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Aug 07, 2023

Expression de méthyl/alkyl coenzyme M réductases divergentes à partir d'archées non cultivées

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 5, Article number: 1113 (2022) Citer cet article

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Les méthanogènes et les archées anaérobies oxydant le méthane (ANME) sont des acteurs importants du cycle global du carbone. La méthyl-coenzyme M réductase (MCR) est une enzyme clé du métabolisme du méthane, catalysant la dernière étape de la méthanogénèse et la première étape de l'oxydation anaérobie du méthane. Des gènes mcr et de type mcr divergents ont récemment été identifiés dans des lignées d'archées non cultivées. Cependant, l'assemblage et la biochimie des MCR d'archées non cultivées restent largement inconnus. Nous présentons ici une approche pour étudier les MCR d'archées non cultivées par expression hétérologue dans un méthanogène, Methanococcus maripaludis. Le promoteur, la structure de l'opéron et la température étaient des déterminants importants pour la production de MCR. Le MCR méthanococcique recombinant et le MCR ANME-2 se sont assemblés avec le MCR hôte pour former des complexes hybrides, tandis que le MCR ANME-1 testé et l'éthyl-coenzyme M réductase ne formaient que des complexes homogènes. Avec la modélisation structurelle, cela suggère que les MCR ANME-2 et méthanogène sont structurellement similaires et que leurs directions de réaction sont probablement régulées par la thermodynamique plutôt que par des différences structurelles intrinsèques.

Les méthanogènes ou archées méthanogènes sont considérées comme l'une des premières formes de vie microbienne sur Terre1,2 et, avec les archées anaérobies oxydant le méthane (ANME), elles jouent un rôle central dans le cycle mondial du carbone. Aujourd'hui, les méthanogènes produisent environ un milliard de tonnes de méthane par an dans des environnements anoxiques en utilisant divers substrats, notamment le H2/CO2, le formiate, l'acétate et les composés méthylés en C13, ainsi que ceux récemment découverts, notamment les composants du charbon4,5 et les alcanes à longue chaîne6. Dans les sédiments marins anoxiques, on estime qu'environ 90 % du méthane biogénique est oxydé par l'ANME en CO2 en utilisant une voie de méthanogenèse inverse7, atténuant la libération de méthane dans l'atmosphère.

Tous les ANME et de nombreux méthanogènes restent non cultivés en tant que cultures monospécifiques. Sur la base des métagénomes environnementaux et des cultures d'enrichissement, les ANME sont biochimiquement et génétiquement étroitement liés aux méthanogènes, partageant un ensemble similaire d'enzymes pour l'oxydation anaérobie du méthane (AOM) dans la direction opposée à la formation de méthane8,9,10,11. L'ANME utilise le méthane comme source de carbone et d'énergie et transfère les électrons du méthane vers des partenaires bactériens sulfato-réducteurs syntrophiques9,12,13 ou des accepteurs d'électrons inorganiques, tels que le nitrate14, Fe(III)15,16,17 et Mn(IV)15 . Les ANME connues ne constituent pas un groupe taxonomique unique et appartiennent aux ordres « Ca. Methanophagales » (ANME-1) et Methanosarcinales (ANME-2 et ANME-3)10. L'ordre des Methanosarcinales contient également des méthanogènes. Les détails physiologiques et biochimiques de l'ANME restent largement inconnus en raison du manque de cultures pures et de la lente croissance des enrichissements8,18.

La méthyl-coenzyme M (CoM) réductase (MCR) est une enzyme clé du métabolisme anaérobie du méthane19. Il catalyse la dernière réaction de formation de CH4 dans la méthanogenèse et la première réaction d'activation de CH4 dans l'AOM. La réversibilité de la réaction MCR (réaction 1) a été démontrée expérimentalement avec un Methanothermobacter marburgensis MCR20. Récemment, l'alkyl-coenzyme M réductase (ACR) apparentée a été proposée pour catalyser l'oxydation des alcanes à chaîne courte (par exemple, l'éthane, le propane et le butane) par des archées anaérobies oxydant les alcanes (ANKA)21,22,23,24.

Le complexe MCR est composé d'un dimère d'hétérotrimères (αβγ)2 avec une molécule de la coenzyme tétrapyrrole contenant du Ni F430 dans chacun des deux sites actifs25. Chaque F430 est profondément enfoui dans le complexe protéique et accessible uniquement de l'extérieur par un canal de 50 Å formé de plusieurs sous-unités, McrA, A', B et G ou McrA', A, B' et G'26,27. L'état d'oxydation Ni(I) du F430 est requis pour l'activité. Le couple Ni(II)/Ni(I) a un potentiel redox extrêmement négatif (Eo') inférieur à ‒600 mV28, et donc le MCR est très sensible à l'oxygène et nécessite un système enzymatique complexe pour l'activation réductrice dépendante de l'ATP29. Plusieurs modifications post-traductionnelles uniques (PTM) sont présentes dans la sous-unité McrA et affinent la stabilité et l'activité du MCR30,31,32. Bien que les structures cristallines d'un ANME-1 MCR33 et d'une éthyl-coenzyme M réductase (ECR) 34 aient été résolues, l'assemblage et les propriétés biochimiques des enzymes ANME et ANKA restent mal compris. L'expression hétérologue des gènes codant pour un ANME-1 MCR chez Methanosarcina acetivorans a stimulé l'oxydation du méthane par l'organisme recombinant, fournissant une preuve supplémentaire du rôle de ces enzymes35. Récemment, le Methanothermococcus okinawensis MCR a été exprimé de manière hétérologue dans le méthanogène modèle Methanococcus maripaludis36. Ici, nous avons développé l'expression hétérologue des MCR chez M. maripaludis qui ouvre la voie à l'étude des complexes enzymatiques des archées non cultivées.

Des études récentes de génomique environnementale ont révélé de nombreuses lignées archées de méthanogènes potentiels et d'ANME qui n'ont pas été cultivées à ce jour10. Ici, nous avons étudié la distribution des homologues de MCR sur 1070 génomes d'archées assemblés à partir de la base de données de taxonomie du génome (GTDB) avec une complétude > 80 % et une contamination < 10 %. Au total, 307 génomes contenaient les trois gènes (mcrA, mcrB et mcrG) nécessaires pour coder les sous-unités MCR (Données supplémentaires 1). Dans l'arbre phylogénétique normalisé par rang basé sur les 1070 génomes37, ces archées contenant mcr comprenaient des méthanogènes, ANME-1, ANME-2, ANKA et d'autres archées de types métaboliques inconnus et étaient entrecoupées de lignées qui ne partagent pas ces gènes ( Fig. 1). La distribution généralisée des gènes mcr chez les archées soutient l'hypothèse selon laquelle le métabolisme du méthane est un trait ancien probablement présent dans la racine archée38,39,40.

Un total de 307 gènes mcr ont été identifiés à partir de 1070 génomes d'archées, y compris les méthanogènes (n = 252), le clade ANME-1 (n = 5), l'ANME-2 (n = 20), l'ANKA (n = 9) et d'autres archées avec métabolisme inconnu (n = 21). Les numéros d'accession sont donnés dans les données supplémentaires 1. Nuance de couleur : vert, méthanogènes ; violet, archées ANME-1; rouge, archées ANME-2; orange, ANKA proposés ; gray, archaea contenant mcr avec des fonctions inconnues. Les structures d'opéron (mcrBDCGA, mcrBDGA ou mcrBGA) sont représentées par plusieurs anneaux en dehors de l'arbre phylogénétique normalisé par rang. BDCGA (en bleu), opéron mcrBDCGA ; BDGA (en cyan), opéron mcrBDGA ; BGA (en magenta), opéron mcrBGA ; inhabituel (en noir), les gènes mcr n'ont pas les trois structures d'opéron communes reconnues. Plusieurs occurrences d'un même génome indiquent la présence de plusieurs copies de mcr. Classification taxonomique : embranchement P, classe C, ordre O, famille F, genre G, espèce S. Les lignées sans mcr ont été tronquées au niveau de l'ordre.

En plus des gènes de structure, de nombreux opérons mcr codent pour deux protéines accessoires, McrC et McrD. Bien que les rôles de McrC et D ne soient pas bien caractérisés, il a été démontré que McrC participe au complexe d'activation de MCR29 et que McrD peut faciliter l'ajout de coenzyme F430 au complexe41. Trois structures majeures d'opéron mcr ont été identifiées, mcrBDCGA, mcrBDGA et mcrBGA, qui possédaient un fort signal phylogénétique (Fig. 1). Notamment, les génomes du méthanogène et de l'ANME-2 contenaient principalement les opérons mcrBDCGA et mcrBDGA ; tandis que les génomes ANME-1 possédaient l'opéron mcrBGA plus court avec mcrC à un locus séparé (Fig. 1). Les génomes ANKA possédaient principalement un ou plusieurs opérons mcrBGA et/ou mcrBAG. L'absence d'homologues mcrD dans les génomes ANME-1 et ANKA peut être emblématique d'autres différences majeures avec les enzymes des méthanogènes. Par exemple, ils contiennent des cofacteurs F430 modifiés contenant du nickel, par exemple, le F430 thiométhylé d'un ANME-1 MCR33 et le F430 diméthylé de Candidatus Ethanoperedens thermophilum MCR34.

Les duplications de gènes de mcr sont courantes chez les archées. Parmi les méthanogènes, de nombreux génomes des ordres Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales ont une copie de mcrBDCGA et une seconde copie de mcrBDGA ou mcrBGA (Données supplémentaires 1). Chez M. marburgensis, les deux isoenzymes MCR sont exprimées de manière différentielle en fonction des concentrations de H242,43,44, ce qui suggère que les duplications de mcr peuvent jouer un rôle dans les acclimatations physiologiques à des conditions de croissance variées. D'autre part, les génomes ANKA proposés ont souvent plusieurs opérons mcrBGA/BAG, ce qui suggère que les duplications de mcr peuvent avoir étendu sa fonction du métabolisme du méthane au métabolisme des alcanes multi-carbones.

L'expression hétérologue des MCR chez M. maripaludis a été optimisée systématiquement. Tout d'abord, un promoteur d'histone constitutif (PhmvA)36 a été comparé à un promoteur dépendant du phosphate récemment développé (Ppst)47, qui initie l'expression lors de la limitation du phosphate et sépare partiellement l'expression de la croissance. Une étiquette Flag-Strep2 a été ajoutée à l'extrémité N-terminale de McrG à partir de l'opéron Methanococcus aeolicus mcrBDCGA (Fig. 2a). Sur la base d'un transfert Western d'une étude précédente, les promoteurs PhmvA et Ppst ont donné M. aeolicus MCR (MCRaeo) de 2,4 % et 5,8 % de la protéine totale, respectivement47. Ainsi, le promoteur Ppst était supérieur et utilisé dans les expériences ultérieures. Deuxièmement, l'effet de l'emplacement des étiquettes a été examiné. L'étiquette Flag-Strep2 a été ajoutée à l'extrémité N-terminale de McrG (NG), à l'extrémité N-terminale de McrB (NB) ou à l'extrémité C-terminale de McrA (CA) de MCRaeo. Les identités des protéines purifiées ont été confirmées par spectrométrie de masse après SDS-PAGE (Fig. 2b). De petites quantités de McrD ont été identifiées en plus des sous-unités McrB, G, A. Dans les trois cas, les rendements de MCRaeo étaient d'environ 6 % des protéines cellulaires totales, ce qui suggère que les emplacements des étiquettes n'affectaient pas le niveau de production de protéines. Les spectres ultraviolet-visible (UV-vis) du MCRaeo purifié présentaient un pic d'absorption maximal à 425 nm, ce qui était typique de l'holoenzyme MCR et légèrement inférieur au maximum d'absorption du F430 extrait au méthanol à 430 nm (Fig. 2c) . Sur la base du coefficient d'extinction molaire ε430nm = 22 500 M−1 cm−1 et d'une analyse basée sur HPLC (Fig. S1 supplémentaire), le MCRaeo purifié avec des étiquettes NB ou NG a été entièrement assemblé avec F430, tandis que l'étiquette CA réduisait la teneur en F430 de 30 % (Fig. 2c). Par conséquent, les emplacements des balises affectaient l'assemblage du F430, et les balises NB et NG convenaient aux productions de l'holo-MCR. Enfin, la présence de PTM - dont la thioglycine, la 1-N-méthylhistidine, la 5-(S)-méthylarginine et la 2-(S)-méthylglutamine - du McrAaeo recombinant a été identifiée par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS /MS) (tableau supplémentaire 1). Cela indiquait que notre système d'expression hétérologue entraînait les mêmes PTM que ceux trouvés pour M. maripaludis et M. okinawenesis étroitement apparentés.

a La structure de l'opéron mcr de M. aeolicus (mcraeo) et M. maripaludis (mcrmar). b Analyse SDS-PAGE des MCRaeo et MCRmar recombinants purifiés par affinité Strep-tag et chromatographie échangeuse d'ions de M. maripaludis. Les poids moléculaires basés sur les standards sont marqués sur la gauche. L'étiquette Flag-Strep2 a été ajoutée à l'extrémité C-terminale de McrA (CA), à l'extrémité N-terminale de McrB (NB) ou à l'extrémité N-terminale de McrG (NG). Toutes les sous-unités ont été identifiées par MALDI-TOF MS et étiquetées à droite. McrG1 et McrG2 représentent respectivement McrG marqué et non marqué. c Spectres UV-visibles de MCRaeo et MCRmar recombinants purifiés (tous à une concentration de 7,5 mg mL-1) comparés à la coenzyme F430 extraite du MCR de M. marburgensis. d L'abondance relative de M. aeolicus (en gris) par rapport à l'hôte M. maripaludis (en orange) MCR dans chaque sous-unité du complexe MCRaeo recombinant purifié déterminé par LC-MS/MS. Les pourcentages de protéine de M. maripaludis dans la protéine totale de chaque sous-unité sont marqués.

Bien que le MCRaeo recombinant se soit assemblé en un holo-complexe, SDS-PAGE a montré que le complexe étiqueté NG contenait une sous-unité McrG2 supplémentaire (Fig. 2b). La spectrométrie de masse a identifié que McrG1 et G2 étaient McrGaeo marqués par Flag-Strep2 et l'hôte non marqué M. maripaludis McrGmar, respectivement. Ce chimérisme a également été observé pour MCRaeo exprimé avec d'autres positions d'étiquette et le MCR recombinant de M. maripaludis (Fig. 2b, d). Le McrG de M. maripaludis représentait 30 ± 6 % du McrG total, quelles que soient les positions des étiquettes. Contrairement à McrG, les analyses LC-MS / MS du complexe MCRaeo recombinant n'ont trouvé que de petites quantités de M. maripaludis McrA et McrB (Fig. 2d). Les complexes chimériques ont ensuite été caractérisés par PAGE native et spectrométrie de masse des protéines intactes (Fig. 3). Deux complexes (complexes I et II) ont été observés pour les MCRaeo et MCRmar recombinants purifiés avec la PAGE native (Fig. 3a). La SDS-PAGE des deux complexes a révélé qu'ils différaient par la présence du M. maripaludis McrG supplémentaire non marqué (Fig. 3b). La spectrométrie de masse des protéines intactes a déterminé que les complexes I et II avaient des masses moléculaires de 288, 4 et 283, 8 kDa, respectivement (Fig. 3c et tableau supplémentaire 2). En conséquence, le complexe I correspondait à un complexe α2β2h2f2, où α, β, h et f correspondent respectivement à M. aeolicus McrA, McrB, marqué McrG et F430. Le complexe II correspondait à un α2β2hγf2 avec γ correspondant au M. maripaludis McrG non marqué (Fig. 3d). Ces résultats indiquent que McrG se lie facilement aux sous-unités McrA et B d'une origine différente.

une analyse Native-PAGE des recombinants purifiés MCRaeo et MCRmar. Les deux constructions avaient une étiquette Flag-Strep2 ajoutée à l'extrémité N-terminale de McrG. b Les deux complexes de MCRaeo ont été élues à partir de tranches de gel de PAGE native, analysées par SDS-PAGE et colorées à l'argent. c Les masses moléculaires natives des complexes MCRaeo I et II ont été déterminées à 288,4 et 283,8 kDa, respectivement, par spectrométrie de masse des protéines intactes. Les charges des pics sont étiquetées. d Modèles des complexes I et II. A, B et Gaeo représentent respectivement les sous-unités McrA, McrB et McrG de M. aeolicus. Gmar désigne l'hôte non étiqueté M. maripaludis McrG. La ligne noire symbolise la balise. F signifie coenzyme F430.

Les protéines accessoires McrC et McrD sont hautement conservées dans les opérons mcr des méthanogènes mais souvent absentes dans ceux de l'ANME et de l'ANKA. Pour étudier leurs rôles dans l'assemblage du MCR, des opérons tronqués de M. aeolicus mcr, notamment mcrBDGA, mcrBCGA et mcrBGA, ont été construits. Dans tous les cas, la balise Flag-Strep2 a été ajoutée à la position NG. Les expressions de MCRaeo à partir des trois opérons tronqués ont donné des complexes similaires à ceux de l'opéron mcrBDCGA complet (Fig. 4a, b). Les spectres UV-vis (Fig. 4c) et l'analyse HPLC ont confirmé le complément complet de F430 dans le MCRaeo purifié. De plus, les principaux PTM étaient également présents (tableau supplémentaire 1). Cependant, les niveaux d'expression des opérons mcr tronqués étaient environ trois fois inférieurs à ceux de l'opéron complet (Fig. 4d), bien que la cause des niveaux réduits de protéines ne soit pas encore claire. Ces résultats ont démontré que la présence de mcrCD à l'intérieur de l'opéron mcr n'était pas nécessaire pour l'assemblage de MCR et les PTM.

une analyse SDS-PAGE du MCRaeo recombinant purifié par affinité Strep-tag et chromatographie échangeuse d'ions. Toutes les constructions avaient une étiquette Flag-Strep2 ajoutée à l'extrémité N-terminale de McrG. Les structures d'opérons sont étiquetées au-dessus de chaque voie. Les poids moléculaires basés sur les standards sont marqués sur la gauche. Toutes les sous-unités ont été identifiées par MALDI-TOF MS et étiquetées à droite. b L'abondance relative de M. aeolicus (en gris) par rapport à l'hôte M. maripaludis (en orange) MCR dans chaque sous-unité des complexes co-purifiés déterminée par LC-MS/MS. Les pourcentages de protéine de M. maripaludis dans la protéine totale de chaque sous-unité sont marqués. c Spectres UV-vis de MCRaeo purifié (tous à une concentration de 7,5 mg mL-1) comparés à la coenzyme F430 extraite de MCR. d Niveaux d'expression de MCRaeo recombinant déterminés par western blot. Les barres d'erreur représentent l'écart type de quatre cultures indépendantes.

Il a été proposé que McrC agisse en trans, c'est-à-dire que la co-transcription de mcrC avec l'opéron mcr n'était pas nécessaire pour sa fonction, sur la base de l'observation que le M. marburgensis McrC était co-purifié avec le complexe d'activation MCR, qui était codé en dehors du opéron mcr29. Pour tester cette hypothèse, deux expériences de pull-down ont été réalisées. Tout d'abord, les gènes mcrBDCGA de M. aeolicus ont été exprimés avec une étiquette Flag-Strep2 à l'extrémité N-terminale de McrC (McrCaeo). Les sous-unités McrA, B et G de M. aeolicus (transcrites à partir d'un plasmide) et de l'hôte M. maripaludis (transcrit à partir du génome) co-purifiées avec le McrCaeo marqué (Fig. 5a, c), suggérant que McrC interagit directement avec les deux MCR indépendamment de la co-transcription. Deuxièmement, le M. maripaludis McrC (McrCmar) marqué par Flag-Strep2 a été exprimé seul à partir d'un plasmide. Le McrCmar marqué a également été purifié avec les trois sous-unités MCR exprimées à partir du génome (Fig. 5a). En outre, d'autres protéines ne provenant pas d'opérons mcr ont été co-purifiées avec McrCaeo et McrCmar marqués. Ces protéines comprenaient deux composants du complexe d'activation MCR précédemment identifiés (composant A2 et protéine marqueur de la méthanogénèse 7) 29 et deux autres protéines marqueurs de la méthanogénèse 3 et 17 (Fig. 5a).

a La construction McrCaeo avait l'opéron mcrBDCGA complet de M. aeolicus avec l'étiquette Flag-Strep2 ajoutée à l'extrémité N-terminale de McrC. La construction McrCmar ne contenait que le mcrC de M. maripaludis avec une étiquette Flag-Strep2 N-terminale. Les protéines co-purifiées avec McrCaeo et McrCmar ont été séparées par SDS-PAGE et identifiées par MALDI-TOF MS. Les protéines uniquement purifiées avec McrCaeo sont marquées en rouge. Outre les sous-unités MCR, les protéines co-purifiées (en gras) comprennent la protéine M. maripaludis A2 (locus tag Mmp_0620), MMP3 (methanogenesis marker protein 3, locus tag Mmp_0154), MMP7 (methanogenesis marker protein 7, locus tag Mmp_0421), MMP17 (protéine marqueur de méthanogenèse 17, étiquette de locus Mmp_0656) et protéine de choc thermique Hsp20 (étiquette de locus Mmp_0684). b La construction McrDaeo avait l'opéron mcrBDCGA complet de M. aeolicus avec l'étiquette Flag-Strep2 ajoutée à l'extrémité N-terminale de McrD. Les protéines co-purifiées avec McrDaeo ont été séparées par SDS-PAGE et identifiées par MALDI-TOF MS. c L'abondance relative de M. aeolicus (en gris) par rapport à l'hôte M. maripaludis (en orange) MCR dans chaque sous-unité des complexes purifiés déterminée par LC-MS/MS. Les pourcentages de protéine de M. maripaludis dans la protéine totale de chaque sous-unité sont marqués.

Deux expériences ont confirmé que McrD fonctionne en trans. Premièrement, l'hôte M. maripaludis McrD était présent dans les MCR recombinants purifiés de M. aeolicus exprimés à la fois par les opérons mcr complets et tronqués dépourvus de mcrD (Fig. 4a). Deuxièmement, l'opéron M. aeolicus codant pour une étiquette Flag-Strep2 à l'extrémité N-terminale de McrD (McrDaeo) a été exprimé à partir d'un plasmide dans M. maripaludis pour une expérience déroulante. Les trois sous-unités MCR de M. aeolicus et de M. maripaludis ont été co-purifiées avec le McrDaeo marqué (Fig. 5b, c), ce qui suggère que McrDaeo a interagi avec le MCR hôte exprimé à partir du génome.

Le système d'expression robuste a été appliqué pour produire des MCR à partir d'archées non cultivées. Deux MCR ANME-1, quatre MCR ANME-2 et un ECR ont été sélectionnés pour l'expression hétérologue (tableau supplémentaire 3). Dans tous les cas, le tag Flag-Strep2 a été ajouté au N-terminal de McrG sous le contrôle du promoteur Ppst. La température a été identifiée comme un facteur important pour la production ANME MCR et ECR. À 37 ° C, la température de croissance optimale de l'hôte M. maripaludis, seuls de faibles niveaux de MCR recombinants ont été détectés par Western blot (Fig. S2 supplémentaire) même si le nombre de copies d'ARNm quantifié par qRT-PCR suggérait un niveau plus élevé d'ARNm. pour le MCR ANME-1_G37 recombinant que le MCR de l'hôte natif (Fig. S3 supplémentaire). Étant donné que de nombreux métagénomes ANME ont été obtenus à partir de sédiments marins profonds où les températures étaient proches de 2 ° C, l'expression à des températures plus basses a été examinée. Suite à une croissance proche du minimum de température de M. maripaludis (25 ° C), l'expression des MCR et ECR ANME s'est beaucoup améliorée. Par exemple, ANME-1_BS et ANME-2b_HR1 représentaient 1 à 1, 5% des protéines cellulaires totales (Fig. S2 supplémentaire). Ces résultats suggèrent que les MCR et ECR de l'ANME sont instables à des températures plus élevées ou susceptibles de se dégrader lorsqu'ils sont exprimés dans M. maripaludis.

Les compositions protéiques du MCR ANME-1_BS purifié (MCRANME-1_BS), du MCR ANME-2b_HR1 (MCRANME-2_HR1) et du Ca. Ethanoperedens thermophilum E50 ECR (ECRE50) a été étudié plus en détail (Fig. 6a). L'analyse par spectrométrie de masse a confirmé que les MCRANME-1_BS et ECRE50 purifiés comprenaient les trois sous-unités McrA, B et G (Fig. 6b, c) sans l'hôte M. maripaludis MCR. En revanche, le McrG marqué d'ANME-2b_HR1 a été co-purifié avec les trois sous-unités MCR de M. maripaludis (Fig. 6d), ce qui suggère que McrGANME-2_HR1 et MCRmar se sont assemblés en un complexe hybride. Les alignements de séquences protéiques ont montré que le McrG de ANME-1 a une extension C-terminale plus longue que celles des méthanogènes, ANME-2 et Ca. E. thermophilum (Fig. S4 supplémentaire) ; cette extension peut inhiber les interactions avec le MCR méthanococcique hôte.

a Informations générales et structures d'opérons de MCRANME-1_BS, MCRANME-2b_HR1 et ECRE50. b–d Analyse SDS-PAGE des MCRANME-1_BS, ECRE50 et MCRANME-2_HR1 purifiés produits à partir de M. maripaludis cultivé à 25 oC. Les poids moléculaires basés sur les standards sont marqués sur la gauche. Les identités des protéines (marquées à droite) ont été confirmées par MALDI-TOF MS. Le McrGANME-2_HR1 marqué co-purifié avec l'hôte MCRmar. e Score total (unité d'énergie Rosetta ; REU) par rapport au graphique I_rmsd pour les simulations d'amarrage locales de McrGANME-1_BS (bleu) et McrGANME-2_HR1 (rouge) au complexe M. maripaludis McrA, B, G. Le tracé affiche 60 000 modèles de notation. Le meilleur modèle obtenu à partir de l'amarrage McrGANME-1_BS avait un I_rmsd de 5,869 Å et un score total de -4965,008. Le meilleur modèle obtenu à partir de l'amarrage McrGANME-2_HR1 avait un I_rmsd de 1,848 Å et un score total de -5133,935. Les dix scores d'énergie les plus faibles avec I_rmsd < 2,5 Å sont étiquetés dans la boîte noire. f, g Modèles structurels avec le plus petit I_rmsd dans la simulation du McrGANME-1_BS (magenta, f) et du McrGANME-2_HR1 (magenta, g) s'arrimant au M. maripaludis McrA (vert), B (cyan), G (jaune ) complexe. Les sous-unités protéiques sont présentées en dessin animé, et F430 et CoB-SH sont représentés dans des modèles de bâton. Un seul site actif composé des sous-unités M. maripaludis McrA (vert), A '(jaune), B (cyan) et ANME McrG (magenta) et un F430 sont indiqués pour plus de clarté. Les acides aminés dans les 8 Å entourant F430 sont représentés en surface. h Les dix acides aminés de McrGANME-2_HR1 dans les 8 Å entourant F430 sont marqués à gauche et représentés dans des modèles de bâton.

La base structurelle de la formation du complexe hybride MCR a été analysée plus en détail par modélisation informatique. Un modèle d'homologie du complexe M. maripaludis MCR a été construit avec RosettaCM48 (Fig. S5 supplémentaire) et utilisé pour l'amarrage des protéines avec McrG de ANME-1_BS et ANME-2b_HR1 par RosettaDock49,50 (Fig. 6e – g). L'amarrage in silico de McrGANME-2_HR1 avec M. maripaludis MCR a réussi avec le plus faible écart quadratique moyen de l'interface (I_rmsd) = 1,848 Å (Fig. 6e). Dans ce modèle, 10 acides aminés de McrGANME-2_HR1 ont été identifiés dans les 8 Å entourant F430 (Fig. 6h), conformément aux sites de liaison F430 rapportés (Fig. S4 supplémentaire) 26,51. En revanche, l'amarrage de McrGANME-1_BS avec M. maripaludis MCR était de mauvaise qualité (I_rmsd = 5,869 Å) (Fig. 6e), et une surface d'interaction à moins de 8 Å n'a pas été observée entre McrGANME-1_BS et F430 (Fig. 6f) . Ces simulations concordaient avec les données expérimentales selon lesquelles les sous-unités ANME-2 et MCR méthanococcique peuvent former un complexe hybride alors que ANME-1 MCR n'est purifié que sous la forme d'un complexe homogène.

Dans cette étude, un système d'expression MCR robuste chez M. maripaludis avec une étiquette Flag-Strep2 sur le N-terminal de McrG sous le contrôle du promoteur Ppst a été développé. Ce système a augmenté l'expression de MCR de deux à trois fois par rapport à d'autres promoteurs, tels que le PhmvA constitutif, et a permis une purification rapide des holo-MCR marqués. En utilisant ce système, les MCR recombinants ont été entièrement assemblés avec la coenzyme F430 et contenaient les PTM présents dans le MCR de M. maripaludis. Bien que le rendement de l'ANME MCR soit actuellement inférieur à celui de la MCR méthanogène, cette étude a marqué une étape importante pour les études biochimiques et mécanistes des homologues de MCR d'archées non cultivées.

Notre expression hétérologue a fourni des informations mécanistes sur l'assemblage du MCR. Auparavant, nous avons proposé un modèle d'assemblage ordonné pour la production de MCR chez M. maripaludis36. Dans ce modèle, la transcription de l'opéron mcr était concomitante avec la traduction et l'assemblage des sous-unités dans l'holoenzyme mature avec les PTM corrects. Bien que les expériences rapportées ici n'aient pas été conçues pour fournir des tests critiques de ce modèle, elles suggèrent que le modèle original était trop simpliste. Par exemple, les gènes des protéines accessoires McrC et McrD n'étaient pas nécessaires dans l'opéron pour un assemblage MCR complet avec insertion F430 et PTM corrects comme le suggérait le modèle précédent. Cependant, le niveau de production complexe a été réduit d'environ 60 % chez M. maripaludis lorsque mcrC et/ou mcrD étaient absents de l'opéron. De plus, des expériences de pull-down ont démontré que ces protéines accessoires peuvent fonctionner en trans. Ces résultats suggèrent que la structure de l'opéron peut jouer un rôle important mais n'est pas essentielle pour l'assemblage du MCR, ce qui est cohérent avec l'absence de mcrC/D dans la plupart des opérons mcr ANME et ANKA. Deuxièmement, bien que le chimérisme des sous-unités McrA et McrB soit faible comme le prédit le modèle d'assemblage ordonné, McrG était hautement chimérique et assemblé en complexes d'origines distinctes. Il est possible que lors de l'assemblage l'ajout de McrG soit moins sélectif que McrA et McrB. Par exemple, McrG pourrait être la dernière sous-unité à rejoindre le complexe McrAB, apportant la coenzyme F430. Alternativement, McrG peut être mobile. Après s'être initialement assemblé dans le MCR comme prédit par le modèle d'assemblage ordonné, il est échangé entre les MCR natifs et recombinants matures. D'autres expérimentations seront nécessaires pour faire la distinction entre ces hypothèses et d'autres.

Notre caractérisation des protéines et notre modélisation structurelle ont démontré que les sous-unités ANME-2 et MCR méthanococcique peuvent former un complexe hybride, ce qui suggère qu'elles sont structurellement et biochimiquement plus similaires les unes aux autres qu'on ne le pensait à l'origine. Les archées ANME-2 appartiennent à l'ordre Methanosarcinales, qui est phylogénétiquement distinct de l'ordre Methanococcales. Bien qu'il ait été démontré que M. marburgensis MCR catalyse des réactions réversibles de production de CH4/oxydation de CH4 in vitro20 et que les archées ANME se sont avérées dominantes dans certains sédiments méthanogènes52,53,54,55, une telle réversibilité n'a pas encore été prouvée dans des conditions physiologiques. Nos résultats ont fourni une preuve supplémentaire que la méthanogénèse et la méthanotrophie sont régulées par des facteurs thermodynamiques plutôt que par des différences intrinsèques de MCR dans les méthanogènes et l'ANME.

La plupart des génomes archéens ont été extraits de la base de données Genome Taxonomy (GTDB, https://gtdb.ecogenomic.org/). Le génome ANME-1_BS (n° d'accès FP565147) provient de la base de données NCBI Nucleotide. La CA. Le génome d'Ethanoperedens thermophilum E50 a été téléchargé à partir de l'assemblage GenBank (n° d'accès GCA_905171685.1)24. Les attributions taxonomiques ont été rendues conformes à la version 95 de la GTDB en utilisant l'analyse de la divergence évolutive relative37. Les génomes ont été analysés avec CheckM56 pour leur exhaustivité et leur contamination. Un ensemble de 1070 génomes avec une complétude> 80% et une contamination <10% ont été sélectionnés pour cette étude. Les gènes mcr ont été recherchés à l'aide de tblastn avec les MCR de la souche S2 de Methanococcus maripaludis et de la souche C2A de Methanosarcina acetivorans comme séquences de requête. Les séquences de sujets identifiées ont été exclues si leurs valeurs Expect (E) étaient supérieures à 1e-5. Les structures des opérons étaient reconnues si les gènes mcr identifiés étaient situés sur le même contig et le même brin et que la distance entre deux gènes adjacents était inférieure à 250 pb.

L'arbre taxonomique du génome a été construit à l'aide de l'analyse phylogénétique graphique57, un outil de dessin d'arbre en ligne de commande basé sur Python développé par le laboratoire Huttentower. La taxonomie et la dénomination du génome sont cohérentes avec la version 9537 de la GTDB. Les modèles des opérons découverts étaient représentés par plusieurs anneaux à l'extérieur de l'arbre phylogénétique circulaire. Plusieurs occurrences d'un seul génome indiquent plusieurs copies de mcr présentes dans ce génome.

Les souches recombinantes de M. maripaludis ont été cultivées en anaérobiose à 25 ou 37 °C. Les cellules ont été cultivées dans des tubes de 28 ml à capuchon en aluminium et scellés par un bouchon en caoutchouc avec 5 ml de milieu au formiate minimal (McF) ou de milieu au formiate riche (McFc, McF plus 2 g L-1 d'acides casamino)58. L'espace de tête était de 104 kPa de N2/CO2 (4:1, vol/vol). Les cultures de 1,5 L ont été cultivées dans un milieu à base de formiate McF avec une limitation (80 μM) de phosphate de potassium dibasique (K2HPO4). L'inoculum a été pré-cultivé dans 5 ml de McFc puis transféré dans McF avec 80 μM de K2HPO4 avant d'inoculer 4% de volume dans les cultures expérimentales. De la puromycine (1,25 ou 2,5 μg mL-1) a été ajoutée si nécessaire. Avant l'inoculation, du sulfure de sodium 3 mM a été ajouté comme source de soufre.

Les gènes mcr ont été clonés dans le vecteur navette pMEV4 avec une étiquette Flag-Strep2 sous le contrôle du promoteur Ppst de 93 pb47. Pour l'expression des protéines, les plasmides ont été transformés dans M. maripaludis S000159 en utilisant la méthode de transformation médiée par le polyéthylène glycol60. Les plasmides ont été maintenus dans les souches recombinantes de M. maripaludis en ajoutant 1,25 ou 2,5 μg mL-1 de puromycine au milieu. Les colonies des transformants sélectionnés ont été vérifiées par PCR et séquençage.

Les cultures de M. maripaludis exprimant MCRaeo ou MCRmar recombinant ont été cultivées à 37 ° C dans 1, 5 L McF avec 80 μM de K2HPO4 jusqu'à ce qu'elles atteignent une absorbance à 600 nm de 0, 5 à 0, 7. La purification des protéines a été effectuée dans des conditions aérobies. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 17 700 × g pendant 20 min à 4 ° C, puis remises en suspension dans 5 ml de tampon de liaison contenant 100 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM de NaCl et Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche, New York , Missouri, États-Unis). Les cellules ont été lysées par sonication (Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 100) en utilisant un cycle de 5 s ON/OFF avec la sortie réglée à 4 et le rapport cyclique réglé à 40 % pendant 20 min sur de la glace. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 17 700 × g pendant 20 min à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires. La fraction surnageante a été chargée sur une colonne contenant 1 ml de résine Strep-Tactin Superflow Plus (IBA Lifesciences, Göttingen, Allemagne) équilibrée avec le tampon de liaison. La colonne a été lavée avec le tampon de liaison et les protéines ont été éluées avec le tampon d'élution contenant du Tris-HCl 100 mM (pH 7,6), du NaCl 150 mM et de la desthiobiotine 2,5 mM. Les fractions éluées ont été dessalées et concentrées avec un filtre centrifuge Amicon Ultra (Millipore, seuil de poids moléculaire de 10 kDa) par centrifugation à 5000 × g pendant 20 min à 4 °C et additionnées de 4 ml de tampon A contenant 50 mM de Tris-HCl ( pH 7,6). La solution protéique a ensuite été chargée sur une colonne échangeuse d'anions Q-Sepharose XK16 équilibrée avec le tampon A en utilisant un système de chromatographie liquide NGC (Bio-Rad). La protéine a été éluée avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de tampon B (tampon A plus NaCl 1 M). Les fractions colorées contenant la coenzyme F430 ont été regroupées et concentrées à 1 ml à l'aide d'un filtre centrifuge de coupure de 10 kDa. Les concentrations de protéines ont été déterminées avec un kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).

Les cultures de M. maripaludis exprimant ANME MCR ont été cultivées à 25 ° C dans 1, 5 L McF avec 80 μM de K2HPO4 jusqu'à ce qu'elles atteignent une absorbance à 600 nm de 0, 5 à 0, 7. La purification de l'ANME MCR a été effectuée en utilisant la chromatographie d'affinité Strep-Tactin comme décrit ci-dessus. Après concentration avec le filtre centrifuge de coupure de 10 kDa, des billes magnétiques Strep-Tactin XT (IBA Lifesciences, Göttingen, Allemagne) ont été utilisées pour purifier davantage les MCR ANME conformément aux instructions du fabricant.

Pour la quantification de la protéine contenant du F430, les spectres d'absorption UV-visible ont été enregistrés sur un spectromètre Agilent Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) avec des échantillons dans une cuvette en quartz de 10 mm de longueur de trajet. La quantité de F430 a été calculée avec un coefficient d'extinction molaire ε = 22 500 M-1 cm-1 à 430 nm.

Pour l'extraction de F430, le MCR purifié a été traité avec un volume égal de méthanol à 100 % et les protéines précipitées ont été éliminées par centrifugation à 17 000 × g pendant 5 min. Le surnageant contenant le F430 libre a été soumis à une analyse par chromatographie liquide haute performance (HPLC) à l'aide d'une colonne C18 (4,6 × 100 mm, 3,5 μm) sur un système Agilent 1260 Infinity équipé d'un détecteur à barrette de diodes (DAD) VL+ comme décrit précédemment41 avec Modifications mineures. Le solvant A était de l'acétonitrile à 10 % et de l'acide formique à 0,5 % dans de l'eau et le solvant B était de l'acide formique à 0,5 % dans de l'acétonitrile à 100 %. Le débit était de 0,5 mL min-1 et le volume d'injection était de 30 μL. L'élution à gradient linéaire a été utilisée de la manière suivante : 0 à 10 % de B sur 25 min, 10 à 100 % de B sur 5 min. Le spectre a été enregistré de 260 à 640 nm. La quantification était basée sur la courbe standard construite avec du F430 authentique (Fig. S1 supplémentaire).

Les sous-unités MCR purifiées ont été séparées sur des gels SDS-PAGE prémoulés à 4–20 % (Bio-Rad), puis colorées avec AcquaStain (Bulldog Bio) ou avec le kit Pierce™ Silver Stain (Thermo Fisher Scientific). Pour la digestion à la trypsine en gel, les bandes de gel ont été coupées en petits morceaux, puis rincées deux fois avec 50 % d'acétonitrile/20 mM de bicarbonate d'ammonium (~ pH 7,5–8). Les morceaux de gel ont été déshydratés en ajoutant 100 % d'acétonitrile et séchés dans un SpeedVac. Diverses quantités d'une solution de trypsine (0,01 µg µL-1 dans du bicarbonate d'ammonium 20 mM) ont été ajoutées jusqu'à ce que les morceaux de gel absorbent totalement la solution. Les échantillons ont été incubés à 37°C pendant une nuit. Les peptides trypsiques ont été extraits des morceaux de gel en incubant deux fois avec 50 % d'acétonitrile/0,1 % d'acide formique. Les extraits ont été séchés par un SpeedVac. Un protocole similaire a été utilisé pour la digestion par la pepsine dans le gel. Après que les morceaux de gel ont été rincés avec 50 % d'acétonitrile/bicarbonate d'ammonium 20 mM pour décolorer, les morceaux de gel ont été rincés avec 0,1 % d'acide formique deux fois avant déshydratation avec 100 % d'acétonitrile. Une solution suffisante de pepsine (Promega, 0,02 mg mL-1 dans du HCl 0,04 M) a été ajoutée pour recouvrir les morceaux de gel. Les échantillons ont été digérés à 37 °C pendant une nuit (16 à 18 h). Les peptides ont été extraits avec 50 % d'acétonitrile dans l'eau. Pour la digestion à la trypsine en solution, les échantillons ont été dilués avec du bicarbonate d'ammonium 20 mM à 0, 5–1 g L-1 et additionnés de dithiothréitol à une concentration finale de 10 mM. Les échantillons ont été incubés à 100 °C pendant 5 à 10 minutes et laissés refroidir à température ambiante. Les protéines ont ensuite été digérées avec de la trypsine dans un rapport de 50:1, protéine sur trypsine (p/p) pendant une nuit à 37 °C. L'échantillon a ensuite été séché dans une vacufugeuse.

Pour l'identification des protéines, l'empreinte de masse peptidique (PMF) des bandes de gel a été analysée par un spectromètre de masse Bruker Autoflex Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Time-of-Flight (TOF). Le composé matriciel acide 2,5 dihydroxybenzoïque (2,5-DHBA) a été dissous dans du méthanol à 50 % pour obtenir une solution d'environ 10 g L-1. Environ 0,5 à 1 μL de la solution de matrice et des solutions d'échantillon (peptides F430 et tryptiques) ont été mélangés et déposés sur une plaque métallique et laissés sécher complètement.

Pour les analyses PTM et les quantifications de l'abondance relative des sous-unités MCR chimériques, les analyses par chromatographie liquide avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) ont été réalisées sur un spectromètre de masse Thermo Fisher LTQ Orbitrap Elite couplé à un système Proxeon Easy NanoLC (Waltham, MA). Les peptides ont été remis en suspension dans de l'acide formique à 0,1 %, puis chargés dans une colonne en phase inverse (colonne/émetteur auto-garnie avec 200 Å 5 µM de résine Bruker MagicAQ C18), puis élués directement dans le spectromètre de masse. En bref, l'élution en gradient à deux tampons (0,1 % d'acide formique comme tampon A et 99,9 % d'acétonitrile avec 0,1 % d'acide formique comme tampon B) a commencé avec 5 % de B, maintenu à 5 % de B pendant 2 min, puis augmenté à 25 % de B en 60 min, à 40 % B en 10 min et à 95 % B en 10 min. La méthode d'acquisition dépendante des données (DDA) a été utilisée pour acquérir les données MS. Un balayage MS d'enquête a d'abord été acquis, puis les 5 premiers ions du balayage MS ont été sélectionnés pour l'analyse CID et HCD MS/MS suivante. Les scans MS et MS/MS ont été acquis par Orbitrap aux résolutions de 120 000 et 30 000, respectivement. Les données ont été acquises à l'aide du logiciel Xcalibur (version 2.2, Thermo Fisher Scientific). L'identification et la caractérisation des modifications des protéines ont été réalisées à l'aide de Thermo Proteome Discoverer (version 1.3/1.4/2.2) avec les programmes Mascot (Matrix Science) ou SEQUEST (Thermo). Les spectres des peptides modifiés ont été inspectés plus avant pour vérifier l'exactitude des affectations. Pour la quantification de l'abondance relative, les aires des pics chromatographiques des peptides identifiés appartenant à la même sous-unité MCR ont été extraites et combinées. L'abondance relative a été calculée par comparaison directe des zones de pointe combinées (Données supplémentaires 2).

Pour la spectrométrie de masse des protéines intactes, le MCR purifié a été préparé à une concentration de 10 μM dans de l'acétate d'ammonium 200 mM (pH 7,6). Les spectres ont été acquis à l'aide d'un instrument 12 T Bruker Solarix FT-ICR-MS. L'échantillon a été introduit dans l'instrument par nano-électrospray avec des pointes émettrices en silice fondue de 30 μm (New Objective, Inc.) à un débit de 300 nL min-1. L'optique ionique a été optimisée pour la transmission d'ions à m/z élevé en réglant toutes les fréquences RF à leurs valeurs les plus basses (octupôle 2,0 MHz, cellule de collision 1,4 MHz et transfert 1,0 MHz) et en utilisant un temps de vol de 3 ms. Les spectres ont été lissés à l'aide d'un filtre Savitzky – Golay dans Bruker DataAnalysis. Les affectations d'état de charge et les masses déconvoluées ont été déterminées manuellement par des techniques standard. En bref, pour chacun des rapports m/z mesurés, la masse a été calculée comme masse = (m/z)zz, où z est la charge. Pour le Complexe I, les pics ont été attribués à z de 28–32. Pour le complexe II, les pics ont été attribués à z de 28–31. Les masses rapportées sont alors les moyennes des valeurs pour chaque rapport m/z, et l'écart type a été calculé à partir de la variation des masses calculées.

Après la séparation des protéines sur des gels SDS-PAGE prémoulés à 4–20% (Bio-Rad), elles ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) activées au méthanol. La liaison non spécifique a été bloquée avec 5 % de lait dans une solution saline tamponnée au phosphate et 0,1 % de Tween 20 (PBST) pendant 1,5 h à température ambiante. Les membranes PVDF ont ensuite été incubées avec des anticorps primaires (dilution 1:1000 ; catalogue n° A8592, Sigma-Aldrich) contre l'étiquette FLAG pendant 1,5 h à température ambiante et lavées trois fois pendant 15 min avec du PBST. Ensuite, des membranes PVDF ont été développées à l'aide du substrat de peroxydase de raifort occidental (HRP) pour une détection chimioluminescente améliorée (n° de catalogue 32132 ; Thermo Fisher Scientific). Comme indiqué précédemment47, l'intensité relative de chaque bande immunoréactive a été estimée avec ImageJ, où une réponse linéaire a été confirmée sur la plage utilisée.

L'extraction d'ARN et la qRT-PCR ont été réalisées comme décrit47. Les amorces ont été conçues sur la base des séquences d'ADN des gènes mcrA et ANME-1_G37 mcrB de M. maripaludis à l'aide du logiciel Thermo Fisher Primer Express v3.0.1, avec une température de fusion de 60 °C. Les séquences d'amorces étaient les suivantes : 5'-GTTCACCCTTCCCTTGCATG-3' (M. maripaludis mcrA-forward) ; 5'-TGTTGATGTCGATTAAGAATCTGCT-3' (M. maripaludis mcrA-reverse); 5ʹ-TCGTTAACCTGACCATTCGGA-3ʹ (G37 mcrB-avant); 5ʹ-CCGCGGATTACCATTCCTTT-3ʹ (G37 mcrB-inverse). Des courbes standard ont été créées avec des dilutions en série de 10 fois entre 109 et 105 copies par réaction. Pour qRT-PCR, 30 ng d'ARN total ont été utilisés pour chaque réaction de PCR. Tous les échantillons correspondent à la courbe standard et l'efficacité d'amplification était de 97 % avec un R2 de 0,99.

RosettaCM, une méthode améliorée de modélisation comparative, a été utilisée pour obtenir les structures optimisées48. Le MCR de M. maripaludis a été modélisé à l'aide des MCR de Methanopyrus kandleri (code PDB 1E6V), Methanosarcina barkeri (code PDB 1E6Y), Methanothermobacter thermautotrophicus (code PDB 1HBM), Methanothermobacter marburgensis (code PDB 3POT, 5A8R), Methanothermobacter wolfeii (code PDB 5A8K , 5A8W), un archéon non cultivé (code PDB 3SQG), Methanothermococcus thermolithotrophicus (code PDB 5N1Q), Methanotorris formicicus (code PDB 5N28) et Methermicoccus shengliensis (code PDB 7NKG) comme modèles. Les modèles de l'ANME-2_HR1 McrG étaient basés sur les MCR de Methanosarcina barkeri MCR (code PDB 1E6Y), Methanothermobacter thermautotrophicus (code PDB 1HBM), Methanothermobacter marburgensis (code PDB 3POT, 5A8R), Methanothermobacter wolfeii (code PDB 5A8K, 5A8W), et Methermicoccus shengliensis (code PDB 7NKG) comme modèles. Des recherches d'amarrage locales ont été effectuées à l'aide de RosettaDock (Rosetta version 3.12)49,50, et une structure de départ a été générée à partir de la structure d'entrée pré-emballée avec des perturbations gaussiennes aléatoires de 3 Å pour la translation et de 8° pour la rotation ("-docking:dock_pert 3 8"). La bibliothèque de rotamères par défaut a été ajoutée avec des rotamères aromatiques chi1 et chi2 supplémentaires ("-ex1 -ex2aro"). Les partenaires d'amarrage définis par les ID de chaîne se sont assurés que l'ANME McrG était déplacé autour du trimère de M. maripaludis McrA, B et A'. ("-docking:partenaires ABD_C"). Environ 60 000 modèles ont été produits dans chaque cycle d'amarrage ("-nstruct 60000").

Un certain nombre de mesures de précision structurelle sont régulièrement utilisées pour mesurer les performances d'amarrage, telles que définies par les évaluateurs de l'évaluation critique des interactions protéiques (CAPRI)61. I_rmsd est défini comme l'écart quadratique moyen (RMSD) des atomes lourds dans les résidus d'interface après superposition de ces mêmes résidus, où l'interface est définie comme tous les résidus avec une distance intermoléculaire d'au plus 8 Å. Nous avons classé nos résultats d'amarrage en fonction de l'obtention ou non d'un entonnoir d'amarrage. Selon les critères définis par CAPRI, un modèle avec I_rmsd < 1,0 Å était considéré comme de haute qualité, 1,0 Å < I_rmsd < 2,0 Å était considéré comme de qualité moyenne et 2,0 Å < I_rmsd < 4,0 Å était considéré comme une qualité acceptable. Les structures ont été visualisées et ajustées dans PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, version 2.5, Schrödinger).

Le nombre d'échantillons pour chaque expérience est fourni dans les légendes des figures et les informations supplémentaires. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 9 et les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont disponibles dans les fichiers papier et d'informations supplémentaires. Les transferts Western originaux non recadrés et les gels utilisés dans le manuscrit sont présentés dans la Fig. S6 supplémentaire. Les données brutes de spectrométrie de masse pour la quantification de l'abondance relative sont incluses dans les données supplémentaires 2. Les données brutes pour le traçage des figures sont incluses dans les données supplémentaires 3. Les plasmides utilisés dans cette étude sont accessibles dans Addgene sous les codes d'accès 192763, 192764, 192765, 192766. , 192767, 192768, 192769, 192770, 192771, 192772, 192773, 192774, 192775, 192776, 192777, 192778.

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Nous remercions Steven Mansoorabadi (Université d'Auburn) pour ses précieuses discussions et Saw Kyin (Princeton Proteomics & Mass Spectrometry Facility) pour certaines des analyses de spectrométrie de masse des protéines. La construction de plasmides et l'analyse bioinformatique ont été soutenues par une subvention de la société de recherche et d'ingénierie ExxonMobil à WBW et ECD, et la caractérisation des protéines purifiées a été soutenue par la subvention du département américain de l'énergie (DE-SC0018028) à WBW et ECD. l'analyse par spectrométrie de masse native a été soutenue par une subvention d'instrumentation 1S10 OD025118. Thermo Orbitrap Elite et FT-ICR ont en outre été soutenus par des subventions S10RR028859 et S10OD025118 à l'installation de protéomique et de spectrométrie de masse de l'Université de Géorgie.

Département de microbiologie, Université de Géorgie, Athènes, Géorgie, États-Unis

Nana Shao et William B. Whitman

EMTEC IT, ExxonMobil Technical Computing Company, Annandale, NJ, États-Unis

Fan Yu

Département de chimie, Université de Géorgie, Athènes, Géorgie, États-Unis

Chau-Wen Chou, Robert V. Williams et I. Jonathan Amster

Département de chimie et de biochimie, Université d'Auburn, Auburn, AL, États-Unis

Shadi Yavari et Evert C. Duin

Sciences de l'énergie, ExxonMobil Technology & Engineering Company, Annandale, NJ, États-Unis

Stuart M. Brown et Yuchen Liu

Sciences biomédicales, ExxonMobil Technology & Engineering Company, Annandale, NJ, États-Unis

Ian J.Drake

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NS, YL, ECD et WBW ont conçu la recherche. NS a réalisé des expériences de génétique et de purification et de caractérisation des protéines. Le CWC a réalisé la plupart des analyses par spectrométrie de masse des protéines. YF et SMB ont effectué des analyses bioinformatiques et une modélisation structurelle des protéines. SY a réalisé l'expérience de pull-down McrCmar. RVW a effectué la spectrométrie de masse des protéines intactes dans le laboratoire de l'IJAIJD a effectué les expériences de qRT-PCR. Tous les auteurs ont analysé les données. NS, YL et WBW ont rédigé le manuscrit, qui a été édité par tous les auteurs.

Correspondance avec William B. Whitman ou Yuchen Liu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Alfred Spormann, Jennifer Glass et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Zhijuan Qiu et Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Shao, N., Fan, Y., Chou, CW. et coll. Expression de méthyl/alkyl coenzyme M réductases divergentes à partir d'archées non cultivées. Commun Biol 5, 1113 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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Reçu : 06 mai 2022

Accepté : 30 septembre 2022

Publié: 20 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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