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Aug 05, 2023

Evolution de la fonctionnalité enzymatique dans la flavine

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1042 (2023) Citer cet article

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Parmi les mécanismes moléculaires d'adaptation en biologie, la diversification fonctionnelle enzymatique est indispensable. En permettant aux organismes d'élargir leurs répertoires catalytiques et d'adopter des chimies fondamentalement différentes, les animaux peuvent exploiter ou éliminer de nouvelles substances et xénobiotiques auxquels ils sont exposés dans de nouveaux environnements. Ici, nous explorons les monooxygénases contenant de la flavine (FMO) qui sont essentielles à la désintoxication des xénobiotiques. En utilisant une approche de paléobiochimie en combinaison avec des techniques d'enzymologie, nous divulguons l'ensemble des substitutions historiques responsables de la diversification fonctionnelle de la famille chez les tétrapodes. Remarquablement, quelques remplacements d'acides aminés différencient une FMO multitâche ancestrale en une monooxygénase plus spécialisée en modulant l'intermédiaire oxygénant de la flavine. Nos découvertes étayent une prémisse continue selon laquelle la fonction enzymatique repose sur un sous-ensemble de résidus qui ne se limite pas au noyau du site actif.

Les monooxygénases contenant des flavines (FMO) sont des enzymes et des actifs clés dans l'arsenal de détoxification des vertébrés1,2. Les FMO sont généralement connus pour leur capacité à convertir des molécules contenant des hétéroatomes en leurs oxydes solubles dans l'eau et facilement excrétables3. Contrairement aux monooxygénases4 du cytochrome P450 contenant de l'hème plus spécifiques, les FMO peuvent accueillir une pléthore de substrats dans leurs sites actifs5. De plus, ils catalysent également des étapes clés dans l'activation des médicaments anti-inflammatoires et anticancéreux6,7 et sont impliqués dans la synthèse endogène de substances essentielles dont la taurine8. Pour toutes ces oxydations, les FMO utilisent l'oxygène moléculaire (O2) et le NADPH comme donneur d'hydrure. Les FMO humaines sont liées à des maladies et à des troubles, la triméthylaminurie, communément appelée syndrome de l'odeur de poisson, étant l'exemple le plus connu causé par des mutations dans un gène codant pour la FMO9,10.

Le génome humain code pour cinq paralogues FMO (FMO1-5) avec un supplémentaire décrit comme un pseudogène (FMO6)11. Fait intéressant, cet arrangement à cinq paralogues est conservé dans pratiquement tous les tétrapodes. Les FMO 1 à 4 partagent essentiellement les mêmes propriétés catalytiques en effectuant les réactions canoniques décrites pour la famille : oxydations de sulfure et d'amine (ci-après S/N ou hétéroatome)8,12. Au contraire, le FMO5 a longtemps été considéré comme un FMO13 "pseudo-actif". Ce n'est que récemment en 2016 que Fiorentini et al. ont démontré que le FMO5 humain était capable de réaliser une chimie fondamentalement différente en insérant un atome d'oxygène dans la liaison C-C des cétones et des aldéhydes, une réaction connue sous le nom d'oxydation de Baeyer-Villiger (ci-après BV)14. Les deux chimies différentes, les oxydations S/N et BV, sont obtenues par des mécanismes catalytiques distincts médiés par un intermédiaire réactif oxygénant commun, la C4a-(hydro)peroxyflavine, souvent définie comme un "pistolet armé" dans la littérature FMO15,16 (Fig. 1). Les oxydations S/N fonctionnent via un mécanisme de substitution électrophile partagé avec l'intermédiaire protoné flavine attaquant le substrat riche en électrons15. Au contraire, la réaction BV implique la forme déprotonée de la C4a-peroxyflavine avec formation d'un adduit tétraédrique - l'intermédiaire de Criegee - entre l'intermédiaire oxygénant de la flavine et le substrat. L'oxygénation BV impose des préaménagements structuraux exigeants dans le site actif pour accueillir les espèces formées lors de la catalyse et la migration d'un centre carboné17. Nos travaux antérieurs sur la reconstruction des FMO de mammifères suggèrent que les chimies distinctes S/N et BV ont déjà été définies chez les mammifères et vraisemblablement à l'émergence de chaque clade paralogue, ce qui implique l'existence de deux variétés de FMO, l'une dédiée aux oxydations S/N (FMO1–4) et l'autre aux oxydations BV (FMO5)18,19.

La structure moléculaire récurrente représente le fragment isoalloxazine du cofacteur FAD où R correspond à la queue ribityl adénosine. E signifie enzyme. Premièrement, le FAD oxydé (E-FAD) est réduit par le NADPH. L'enzyme réduite (E-FADH2) réagit facilement avec l'O2 formant l'enzyme oxygénante intermédiaire C4a-flavine(hydro)peroxyde (E-FADOO(H)). Deux mécanismes sont possibles à partir de là, l'oxydation S/N ou l'oxydation BV, toutes deux suivies d'une libération ultérieure de H2O et de NADP+. En l'absence de substrat, l'enzyme subit un cycle futile de production de peroxyde d'hydrogène appelé découplage.

La reconstruction de séquences ancestrales (ASR) combinée à des méthodologies biochimiques et biophysiques s'est avérée être une stratégie puissante pour dévoiler les causes historiques et physiques de la fonction des protéines20,21. L'évolution des stratégies pour faire face aux substances nocives et toxiques a été cruciale pour la survie de toutes les formes de vie. En nous appuyant sur ce principe, nous avons pensé que les FMO tétrapodes seraient une étude de cas perspicace pour apprendre comment la fonctionnalité enzymatique se diversifie au cours de l'évolution (c'est-à-dire : S/N vs oxydations BV). Les FMO sont des enzymes catalytiquement complexes. La catalyse dépend d'un groupe prothétique (le FAD), d'un co-substrat (l'oxygène moléculaire), d'un donneur d'électrons (NADPH), du substrat et de la matrice protéique (Fig. 1). Dans ce travail, nous traçons les substitutions historiques qui, collectivement, affinent le jeu de ces nombreux acteurs catalyseurs22,23. Pour les FMO, la diversité fonctionnelle est causée par un réseau de résidus en dehors du site actif, qui module la formation de l'intermédiaire flavine oxygénant.

L'histoire évolutive des FMO de vertébrés a été déduite par le maximum de vraisemblance et des méthodes bayésiennes utilisant un ensemble de données représentatif comprenant des séquences de tous les vertébrés terrestres et des poissons osseux en tant que groupe externe (Figs. 1 et 2 supplémentaires). Les FMO ont évolué d'une séquence à copie unique chez les vertébrés à mâchoires précoces à l'arrangement à cinq/six paralogues chez les mammifères et d'autres grandes classes d'animaux. Comme nous l'avons signalé précédemment, cette explosion de paralogues coïncide avec l'émergence de tétrapodes18. En tenant compte du profil fonctionnel des mancFMOs18 et des FMOs existants24, les activités des clades ont été prédites (Fig. 2a). Cela a mis en évidence l'existence de deux trajectoires fonctionnellement divergentes de l'ancêtre commun de tous les tétrapodes FMO aux paralogues existants. Trois hypothèses tout aussi parcimonieuses expliquant la divergence fonctionnelle, S/N vs BV oxydations, pourraient être envisagées. Premièrement, l'ancêtre tétrapode n'était capable d'oxygéner que des hétéroatomes et la capacité d'effectuer des oxydations BV est apparue dans le clade FMO5. A priori, ce serait le scénario le plus probable compte tenu de l'activité canonique des FMO25. Alternativement, l'ancêtre tétrapode était promiscuité portant les deux activités, et après l'événement de duplication, les enzymes se sont spécialisées au fil du temps. Enfin, l'ancêtre tétrapode n'était capable d'effectuer que des oxydations BV et après un événement de duplication, les changements permettant les oxygénations S / N ont été introduits dans la lignée FMO1–4.

a Phylogénie effondrée des FMO de vertébrés à mâchoires avec les ancêtres ciblés aux nœuds : (1) tAncFMO1–5, (2) tAncFMO5, (3) tAncFMO1–4 et (4) tAncFMO1–3 (cercles jaunes). Les clades sont colorés en fonction de l'activité de l'ancêtre mammifère : oxydation S/N (bleu), oxydation BV (orange). Aucune confirmation expérimentale de l'activité FMO4 n'est disponible. Les silhouettes représentées représentent le tétrapode ancestral (par Dmitry Bogdanov (vectorisé par T. Michael Keesey) sous CC BY-SA 3.0) et les actinoptérygiens (poissons à nageoires rayonnées). La barre d'échelle représente les substitutions par site. b Cinétique à l'état d'équilibre pour tAncFMO1–4 vers NADPH (ligne rouge, KM = 15,7 ± 1,8 μM) et NADH (ligne bleue, KM = 90 ± 17,6 μM). Le sulfure de méthyl-p-tolyle (MPTS) a été utilisé comme substrat. Les taux observés ont été obtenus en suivant le changement d'absorbance à 340 nm. Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes et les barres d'erreur correspondent à SD (n = 3 expériences indépendantes). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. c Essais de conversion avec les trois ensembles de substrats pour tester les activités d'oxydation S/N et BV. Les FMO ancestrales de mammifères (mAncFMO18,19) ont été incluses dans l'analyse. Les barres représentent les valeurs de conversion moyennes et les points les valeurs pour chaque expérience (n = 2 expériences indépendantes). Les oxydations S/N sont représentées en bleu tandis que les oxydations BV sont en orange. Les données sources sont fournies dans le tableau supplémentaire 4.

Dans le but de comprendre le cheminement vers la divergence fonctionnelle, nous avons décidé de ressusciter les ancêtres avant et immédiatement après l'expansion familiale. Quatre nœuds ont été spécifiquement ciblés pour leur caractérisation expérimentale : tAncFMO1–5, tAncFMO5, tAncFMO1–4 et tAncFMO1–3 (Fig. 2a). Tous les ancêtres ont été déterminés comme ayant la même longueur (532 acides aminés) et ont été reconstruits avec une grande confiance (probabilités postérieures globales (\(\overline{{PP}}\)) > 0,94) (Fig. 3 supplémentaire). tAncFMO1-5 (\(\overline{{PP}}\) = 0,95) est l'ancêtre antérieur au premier événement de duplication (englobant tous les paralogues FMO de tétrapodes), tandis que tAncFMO5 (\(\overline{{PP}}\) = 0,96) et tAncFMO1–4 (\(\overline{{PP}}\) = 0,94) sont ses paralogues filles, ancêtres de chaque lignée fonctionnellement diverse. À l'intérieur du clade FMO1–4, d'autres événements de duplication se sont produits, le premier d'entre eux étant à l'origine du clade FMO4 et tAncFMO1–3 (\(\overline{{PP}}\) = 0,95) qui a également été ressuscité. De cet ancêtre (tAncFMO1–3), le groupe FMO2 a été le suivant à émerger, suivi de FMO1 et FMO3, ce dernier se dupliquant davantage uniquement chez les mammifères pour donner naissance à FMO6, un pseudogène chez l'homme21. Le but de l'ASR étant de retrouver le phénotype des molécules éteintes plutôt que leur séquence précise, l'incertitude dans la reconstruction doit être prise en compte26. Par conséquent, les séquences d'ancêtre alternatives (Alt_tAncFMOs) ont également été obtenues. Ceux-ci affichent la combinaison des états de second choix sur tous les sites reconstruits de manière ambiguë27 (voir Méthodes).

Tous les nœuds sélectionnés pouvaient être exprimés sous forme de protéines liées à la membrane et, lors de la purification, affichaient les propriétés spectrales typiques des enzymes contenant de la flavine (Fig. 4 supplémentaire). Les ancêtres ont montré de très bonnes stabilités thermiques (\(\bar{{T}_{m}}\) \(\sim\) 60 °C, Tableau supplémentaire 1), comparables à celles des AncFMO de mammifères19. Cependant, dans ce cas, la présence de la coenzyme oxydée NAD(P)+ n'a provoqué aucun effet sur les valeurs de Tm. Premièrement, nous avons confirmé que les tAncFMO ressuscités présentaient les caractéristiques cinétiques attendues pour un FMO tétrapode typique. Par exemple, tAncFMO1–4 présentait un comportement typique de Michaelis-Menten vis-à-vis du substrat modèle sulfure de méthyl-p-tolyle (efficacité catalytique (kcat / KM) = 0, 98 s −1 mM −1; Fig. 5 supplémentaire) et une nette sélectivité pour NADPH en tant que donneur d'hydrure sur NADH (Fig. 2b). Leurs affinités O2 (KMO2) se sont avérées dans la gamme micromolaire faible, ce qui implique une capacité efficace à utiliser l'oxygène (Fig. 6 supplémentaire, tableau supplémentaire 2). De plus, bien que les enzymes ressuscitées puissent consommer NADPH et NADH en tant que donneurs d'électrons dans la réaction de découplage (Fig. 7 supplémentaire, Tableau supplémentaire 2), des oxygénations significativement plus faibles ont été obtenues lors de l'utilisation de NADH par rapport à NADPH (par exemple : tAncFMO1–4 + NADH = 15 % de conversions de substrat, tAncFMO1–4 + NADPH = 100 % de conversions ; Fig. 8 supplémentaire). Cette dépendance aux coenzymes est en ligne avec la prépondérance du NADPH dans les systèmes de défense cellulaire antioxydante28 et prouve que l'identité du cofacteur nicotinamide joue un rôle central dans la définition de la fonctionnalité enzymatique. Ensuite, leur comportement catalytique a été évalué à l'aide d'un panel de substrats prototypes pour cribler la capacité à effectuer des oxydations S / N et BV (Fig. 2c; Figs. Supplémentaires 9 et 10, Tableaux Supplémentaires 3 et 4). Nous avons observé que les ancêtres de chaque lignage avaient les mêmes activités que leurs descendants. Plus précisément, tAncFMO1–4 et tAncFMO1–3 effectuaient exclusivement des oxydations S / N, tandis que tAncFMO5 catalysait l'oxydation BV des trois cétones testées avec des conversions partielles ou nulles des substrats contenant des hétéroatomes. En revanche, l'ancêtre de pré-duplication tAncFMO1–5 s'est avéré oxyder les trois types de substrats, étant actif à la fois comme enzyme d'oxygénation S/N et BV. Pour valider la robustesse de la reconstruction, des ancêtres alternatifs ont également été ressuscités (tableau supplémentaire 5). Ils présentaient tous le même phénotype que les tAncFMO respectifs (tableau supplémentaire 4). Ces découvertes ont conduit à une conclusion critique : l'ancêtre de tous les paralogues FMO tétrapodes (tAncFMO1–5) était une enzyme bifonctionnelle capable d'effectuer à la fois des oxydations BV et S/N.

En termes de paysages de fitness dans l'espace de séquence, les multiples activités catalytiques de tAncFMO1–5 peuvent être interprétées comme deux pics qui se chevauchent correspondant aux activités oxydatives BV et S / N (Fig. 3a). Alors que le paralogue fille, tAncFMO1–4 a conservé un seul pic après avoir perdu la capacité d'effectuer des oxydations BV. Pour disséquer les déterminants de séquence des fonctionnalités BV vs S/N, une stratégie de mutation a été conçue en inversant certaines des substitutions historiques de tAncFMO1–4 pour réinstaller l'activité d'oxydation BV. Des modèles structurels de tAncFMO1–5 et tAncFMO1–4 ont été construits par modélisation d'homologie à l'aide de YASARA29 en utilisant le mancFMO5 (PDB: 6SEK) comme modèle et AlphaFold230 (Fig. 11 supplémentaire). Considérant que 45 substitutions se sont produites au niveau de la branche reliant les deux ancêtres, nous avons identifié les mutations "réversibles" en fonction de (i) la probabilité de l'état MAP (maximum a posteriori) pour le site considéré dans la reconstruction, (ii) le degré de conservation dans un alignement de séquences multiples de FMO oxygénant des hétéroatomes et (iii) leur emplacement structurel. Dans un premier cycle d'analyse, des mutants tAncFMO1–4 hébergeant 4, 12 et 16 substitutions présentes dans le site actif, dans les tunnels substrat / produit, à proximité du FAD et dans la première ou la deuxième coquille de résidu autour du NADPH ont été préparés (Fig. 3b, Fig. 12 supplémentaire). Les mutants 16x et 12x ont montré une activité faible mais significative pour le substrat phénylacétone du BV. Pourtant, le mutant 4 × présentait le même profil catalytique que tAncFMO1–4 (Fig. 3c). Par conséquent, un autre sous-ensemble de 4 substitutions à partir du mutant 12 × a été conçu en se concentrant sur la stricte conservation des résidus trouvés dans la lignée FMO5 et sur la question de savoir si des acides aminés donnés étaient engagés dans des interactions de liaison hydrogène. Ce mutant, nommé 4′×, était capable de catalyser les oxydations BV en quantités faibles mais toujours significatives tout en maintenant son activité vis-à-vis des oxydations S/N. Ensuite, pour disséquer lesquelles de ces substitutions sont nécessaires à l'oxydation du BV, des mutants simples, doubles et triples ont été testés (Fig. 3d). Une synergie positive entre I60, H275 et H426 a été révélée car chaque mutant catalysait exclusivement les oxydations S/N tandis que l'oxydation des cétones n'était restaurée que lorsque ces trois substitutions étaient combinées. De plus, la quatrième substitution (N222) semblait avoir un rôle préjudiciable car son inclusion entraînait des conversions plus faibles pour les oxydations BV. Fait intéressant, seul I60 est situé dans le site actif. Sa chaîne latérale hydrophobe est cachée derrière la poche de liaison au substrat, à proximité immédiate de la face si du cycle isoalloxazine (Fig. 4). H275 et H426 sont plutôt vers la périphérie de la protéine, à 3–7 Å de la coenzyme NADP + (Fig. 4b, c). Probablement, ces deux résidus s'engagent dans un réseau de liaisons hydrogène, médié par des molécules d'eau liées à la surface, avec le dinucléotide dans sa poche de liaison (Fig. 4d, e). À partir de cette idée structurelle, il semble clair que le réseau d'interaction responsable de l'activité d'oxydation de BV dans 3 × -tAncFMO1–4 est médié par des interactions couplées avec les cofacteurs NADP + et FAD. Ce type d'interaction a été catalogué comme une épistasie relayée par le ligand et il est considéré comme le réseau de substitution le plus compliqué à établir pour la fonction enzymatique31.

un schéma décrivant la stratégie de mutation inverse en termes de fonctionnalités en tant que paysages dans l'espace de séquence23. b Liste des sites mutés dans chacun des variants construits. Les séries de mutations suivantes sont représentées en échelle de gris. c Conversions catalysées par les mutants tAncFMO1–4 et d disséquant 4′×-tAncFMO1–4. Les barres représentent les valeurs de conversion moyennes et les points les valeurs pour chaque expérience (n = 2 expériences indépendantes). Les données sources sont fournies dans le tableau supplémentaire 4.

un modèle de tAncFMO1–4 avec des résidus 4′× (I60T, N222S, H275N, H426N) représentés en vert. b, c Vues focalisées avec 4′× résidus marqués. Les distances entre un H au Cγ1 de la chaîne latérale I60 et le O au C4 du FAD (2,6 Å) et entre le Nε2 de H275 et le Cε1 de H426 avec deux atomes O de la fraction phosphate de NADP+ (6,7 et 3,3 Å), respectivement, sont indiquées. d Les interactions de liaison hydrogène pour I60 sont indiquées en bleu clair. e Les interactions de liaison hydrogène pour H275 et H426 sont décrites en bleu clair. La structure secondaire et les résidus de tAncFMO1–5 sont représentés en violet. Les molécules FAD et NADP+ sont représentées respectivement en jaune et en bleu.

Le résultat de l'analyse mutationnelle a soulevé des questions concernant la base mécaniste de la spécialisation fonctionnelle des FMO tétrapodes. Pour y répondre, il faut d'abord prendre note d'un trait caractéristique de ces enzymes : le double rôle joué par le NADPH. Le cofacteur réduit d'abord la flavine, puis subit un changement de conformation pour positionner son groupe carbamide à une distance de liaison hydrogène de l'atome N5 de la flavine. Dans cette conformation, le NADP+ favorise de manière critique la formation de la flavine-(hydro)peroxyde à partir de la réaction de la flavine réduite avec l'oxygène moléculaire. Ainsi, le NADPH est à la fois le donneur d'électrons et un élément catalytique intégral, essentiel pour que l'oxygénation du substrat se produise. Compte tenu de ce contexte mécaniste, nous avons d'abord cherché à sonder la réactivité du tAncFMO1–5 et du tAncFMO1–4 avec le NADPH. À l'aide d'analyses cinétiques rapides, nous avons constaté que les deux enzymes sont réduites par le NADPH dans des conditions anaérobies (kred = 0,0097 ± 1,2 × 10−4 s−1 pour tAncFMO1–5 et 0,25 ± 0,016 s−1 pour tAncFMO1–4) (Fig. 13 supplémentaire). Les FMO anaérobies réduits en NADPH ont ensuite été utilisés pour étudier la réactivité des enzymes avec l'O2 (0,62 mM). tAncFMO1-5 et tAncFMO1-4 ont réagi avec l'oxygène à des vitesses similaires (kox = 1,5 ± 0,1 s-1 pour tAncFMO1-5 et 3,2 ± 0,11 s-1 pour tAncFMO1-4) dans un processus typique en deux étapes dans lequel la première étape a donné une espèce avec des propriétés spectrales coïncidant avec celles proposées pour une C4a-(hydro)peroxyflavine (λmax = 380 nm)32 (Fig. 5, Fig. 14 supplémentaire).

Les spectres ont été enregistrés en temps opportun pour surveiller la réaction du tAncFMO1–4 réduit avec l'oxygène moléculaire dans un appareil à flux arrêté. Des exemples représentatifs sont présentés (n = 3 expériences indépendantes). L'encart supérieur gauche montre les spectres déconvolués intégrés dans un processus en deux étapes \(a\mathop{\to }\limits^{{k}_{1}}b\mathop{\to }\limits^{{k}_{2}}c\) avec k1 = 3,2 ± 0,11 s−1 et k2 = 0,0065 ± 0,0001 s−1. L'encart supérieur droit montre le changement d'absorbance entre les espèces a (E-FADH2) et b (E-FADOO(H)). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Une question mécaniste cruciale concerne l'état de protonation de l'intermédiaire réactif, la forme protonée étant principalement attribuée à l'oxydation S/N et la forme déprotonée permettant à la place l'oxydation BV17. Les travaux pionniers du groupe de Massey sur la cyclohexanone monooxygénase ont montré que les spectres de la flavine-(hydro)peroxyde déprotonée et protonée peuvent être différents car la déprotonation conduirait à un décalage vers le bleu du pic d'absorption33. Les expériences à flux arrêté n'ont révélé aucune différence claire dans les spectres intermédiaires du tAncFMO1–5 et du tAncFMO1–4 (Fig. 5, Fig. 14 supplémentaire). Les changements induits par la protonation dans les spectres de flavine-(hydro)peroxyde pourraient ainsi être spécifiques à une enzyme et/ou trop petits pour être mesurables sur ces enzymes. Il est également possible que la diversité fonctionnelle parmi les deux ancêtres provienne d'autres facteurs et pas seulement de la protonation intermédiaire. En supposant un pKa d'environ 8 pour la flavine-(hydro)peroxyde33,34, la population enzymatique sera en partie protonée et en partie déprotonée et potentiellement capable d'oxydations S/N et BV dans nos conditions d'essai. tAncFMO1–5 et tAncFMO5 sont en effet capables des deux réactions (Fig. 2c).

Un indice est offert par le triple mutant T60I, N275H, N426H, restaurant l'activité BV dans tAncFMO1–4. La caractérisation expérimentale de cette variante a montré des caractéristiques spectrales et un comportement cinétique similaires à ceux de tAncFMO1–4 (Figs. 15 et 16 supplémentaires). Aucune de ces mutations seules n'est suffisante pour installer la fonctionnalité BV qui nécessite à la place que les trois soient simultanément présentes. H275 et H426 introduisent des sites chargés positivement dans les résidus de la première et de la seconde enveloppe entourant le NADP+. I60 est physiquement proche de N61, un résidu strictement conservé et essentiel qui est suspendu au-dessus de la flavine N5 et du groupe carbamide voisin du NADP + 35,36 (Fig. 17 supplémentaire). La combinaison de ces résidus pourrait donc légèrement perturber l'électrostatique entourant le centre catalytique et affiner la dynamique locale du NADP+ étroitement lié et catalytiquement essentiel. En conséquence, les mutations T60I, N275H et N426H pourraient permettre la catalyse BV en favorisant électrostatiquement la formation de l'intermédiaire Criegee chargé négativement et en fournissant au site actif l'adaptabilité requise pour la migration des atomes de carbone.

Dans ce travail, en employant une approche historique, nous mettons en lumière l'émergence et le développement de la catalyse dans les FMO animales. La trajectoire de la famille FMO chez les tétrapodes a été fonctionnellement disséquée. Comme résultat, il y a deux aspects notables à discuter ; l'un concernant la catalyse dans les enzymes dépendantes des nucléotides et l'autre lié à la biologie des organismes.

Les FMO sont des enzymes qui catalysent des oxygénations sélectives par l'action précisément orchestrée de plusieurs éléments catalytiques. On sait depuis longtemps que le donneur d'hydrure (NADPH) joue un rôle central, car il reste lié pendant tout le cycle catalytique et sa libération détermine souvent la vitesse de catalyse33. Cependant, la base structurelle de l'influence du donneur d'hydrure dans le type de réaction d'oxygénation est restée inconnue. De même, les réactions archétypales définies pour la famille FMO sont des oxydations de molécules contenant des hétéroatomes11. Le fait qu'il ait été démontré que le FMO5 humain effectuait des oxydations BV était sans aucun doute un changement de paradigme dans la compréhension de cette famille d'enzymes14. En explorant le chemin évolutif des FMO chez les vertébrés à mâchoires en utilisant comme approche principale des techniques de reconstruction de séquences ancestrales et d'enzymologie, nous avons pu comprendre ces deux aspects intrigants de la catalyse des FMO. Les FMO effectuent deux chimies fondamentalement distinctes, les oxydations S / N et BV, via des interactions épistatiques entre les substitutions distales dans le site actif médiées par les cofacteurs nucléotidiques FAD et NADP +. Les déterminants de séquence de ces deux fonctionnalités enzymatiques ne sont pas mutuellement exclusifs, car les deux peuvent coexister dans le même noyau protéique, comme démontré pour le FMO ancestral multifonctionnel (tAncFMO1–5). Cela soulève la possibilité de considérer l'activité BV comme canonique pour la famille des protéines. Cela reste à déterminer jusqu'à ce que davantage de FMO d'autres groupes taxonomiques soient systématiquement caractérisés comme des FMO de mammifères8,14,18,19,37,38. Par conséquent, deux conclusions fondamentales peuvent être esquissées : (i) pour les monooxygénases dépendantes des nucléotides, la fonctionnalité est le résultat d'interactions complexes entre les substitutions fonctionnelles définissant le réseau catalytique interne, l'identité du donneur d'hydrure et la paire substrat/O2 et, (ii) la spécialisation enzymatique peut se produire par le biais de mutations improbables qui ne ciblent pas directement les résidus catalytiques mais modifient plutôt l'équilibre fin des interactions et de la dynamique structurelle de l'enzyme.

Concernant l'aspect biologie des organismes, notre analyse a révélé que tous les FMO tétrapodes existants ont évolué à partir d'une enzyme ancestrale qui a conduit à la fois les monooxygénations de BV et d'hétéroatomes. Cette découverte implique donc que l'activité BV peut avoir été cruciale pour la survie dans le passé et qu'elle n'est pas le résultat d'un événement de néofonctionnalisation. La divergence fonctionnelle observée dans les paralogues FMO modernes est le résultat d'un processus d'optimisation fonctionnelle via la duplication de gènes, conformément au modèle innovation-amplification-divergence (IAD)39. Après le premier événement de duplication, la lignée FMO5 a conservé la fonction enzymatique de l'ancêtre pré-duplication et l'activité d'oxydation du BV perdure dans les espèces modernes14. La lignée FMO1–4 est fonctionnellement optimisée pour l'oxygénation des molécules contenant des hétéroatomes et spécialisée par duplications successives de gènes. Nous émettons l'hypothèse que la transition des vertébrés osseux aux tétrapodes a impliqué des défis environnementaux40 (alimentation, coexistence avec des plantes terrestres, exposition à une concentration plus élevée en O2, etc.) qui ont déclenché l'expansion et la diversification de la famille des FMO. Une idée similaire a été vaguement spéculée dans le passé, reflétant celle proposée pour les CYP41, car les FMO sont capables de transformer les métabolites végétaux en substances moins toxiques42. Cette hypothèse est étayée par la présence d'un seul FMO à copie unique chez les poissons osseux. Les FMO ont augmenté en nombre et sont devenus fonctionnellement diversifiés au fil du temps, conférant aux tétrapodes un système de détoxification très polyvalent, capable de convertir des composés contenant des hétéroatomes et des carbonyles.

La phylogénie FMO des tétrapodes a été construite en utilisant comme source notre ensemble de données précédemment rapporté18. L'ensemble de données a été renforcé comme suit : (i) des séquences FMO d'Homo sapiens précédemment caractérisées expérimentalement ont été utilisées comme requêtes dans les recherches BLASTp dans les séquences de protéines non redondantes GenBank (nr) et dans Uniprot KB. Les recherches ont été restreintes par la taxonomie des organismes par classes ou ordres visant à exploiter toute la diversité des FMO inclus dans les vertébrés terrestres (c'est-à-dire : les classes Amphibia, Aves, Crocodylia, Lepidosauria et Mammalia et l'ordre Testudines) guidées par la base de connaissances TimeTree43. Des groupes de poissons osseux, comme Actinopterygii, Cladistia et Chondrichthyes, ont également été exploités pour collecter des séquences pour la racine. (ii) Les séquences partielles ou de faible qualité (telles que définies par le NCBI44) ont été exclues. (iii) Toutes les séquences collectées ont été rassemblées et analysées dans un alignement de séquences multiples (MSA) à l'aide de MAFFT v745, en supprimant celles qui ont été collectées plus d'une fois. Les séquences correspondant aux véritables ORF ont été conservées dans l'ensemble de données (lorsque cela était nécessaire, cela a été confirmé par des recherches tBLASTn réciproques). Ce processus a assuré la construction d'un jeu de données représentatif et non redondant. Cela comprenait 35, 272, 77, 55, 31 et 66 homologues FMO d'amphibiens, de mammifères, d'oiseaux, de reptiles, de testudines et de poissons osseux, respectivement. Le MSA contenait 536 séquences (613 sites) et il a été coupé manuellement pour les extensions de séquence unique (537 sites) (Données supplémentaires 1). Les paramètres de modèle les mieux adaptés (matrice de substitution JTT et α = 1,114) ont été obtenus par le critère d'information d'Akaike dans ProtTest v3.446. La phylogénie a été déduite par la méthode du maximum de vraisemblance dans RAxML v8.2.10 (module HPC-PTHREADS)47. La robustesse de la topologie a été évaluée en exécutant 500 bootstraps non paramétriques et ceux-ci ont ensuite été soumis à une attente de bootstrap de transfert (TBE) dans BOOSTER48. La phylogénie a également été déduite chez M. Bayes v3.2.649 exécutant 2 000 000 générations jusqu'à ce que la convergence <0,2 (déterminée par l'écart type des fréquences divisées) soit atteinte. Figtree v1.4.2 a été utilisé pour visualiser et éditer les arbres. La reconstruction de la séquence ancestrale a été effectuée dans PAMLX v.4.9 en tant que reconstruction marginale à l'aide du module CODEML50. Les séquences ont été analysées à l'aide d'une matrice de substitution empirique, d'une fréquence d'équilibre empirique des acides aminés (modèle = 3), de 4 catégories gamma (α = 1,114) et d'une matrice de substitution de Jones. La distribution de probabilité a posteriori des états ancestraux sur chaque site a été analysée aux nœuds correspondant à tAncFMO1–5, tAncFMO5, tAncFMO1–4 et tAncFMO1–3. La longueur des ancêtres a été traitée par parcimonie en analysant la présence/absence de gaps dans les nœuds ciblés sur la base de la longueur des séquences dérivées dans chaque clade (algorithme de Fitch)26. Les sites ont été considérés comme reconstruits de manière ambiguë lorsque les états alternatifs affichaient des probabilités a posteriori (PP) > 0,2. Les séquences des ancêtres alternatifs (Alt_tAncFMOs) ont été générées en incluant au total les états de second choix pour les sites reconstruits de manière ambiguë plus les états MAP (PP > 0,8).

La conception des mutants était basée sur une analyse bioinformatique comprenant trois composantes principales : (i) la précision de la reconstruction par site, (ii) le degré de conservation de chaque site et, (iii) l'environnement structurel de chaque site. Tout d'abord, les 45 substitutions au niveau de la branche reliant tAncFMO1–5 à tAncFMO1–4 ont été répertoriées et inspectées pour leur PP lors de la reconstruction. Ceux affichant PP> 0,8 aux deux nœuds ont été sélectionnés pour l'étape suivante, car ils étaient considérés comme de véritables substitutions. De plus, lorsqu'à l'un des nœuds le site inspecté a été reconstruit avec un PP < 0,8 et que l'état alternatif (PP > 0,2) était différent de l'état MAP à l'autre nœud, il a été inclus dans la sélection. Ce premier processus nous a permis de réduire à 27 le nombre de substitutions à inspecter. Ensuite, le degré de conservation de chacun des sites sélectionnés a été analysé à l'aide du serveur ConSurf51. Les sites identifiés comme conservés soit dans l'ensemble de l'ensemble de données, soit uniquement parmi la lignée hétéroatomique oxydative ou la lignée BV ont ensuite été sélectionnés. Enfin, l'environnement structurel de chacun des sites a été inspecté en utilisant les structures de mAncFMO5 (PDB 6SEK) comme modèle pour la lignée BV et de mAncFMO2 (PDB 6SF0) comme modèle pour la lignée oxydante hétéroatomique. Seize sites ont été détectés comme candidats à des tests expérimentaux. Ces sites ont ensuite été divisés en trois sous-groupes selon leur proximité avec le site actif et/ou leur degré de conservation. Ainsi 4x comprenait 4 substitutions au niveau du site actif, 12x comprenait les substitutions de 4x plus 8 sites et 16x comprenait tous les sites sélectionnés.

La structure tridimensionnelle de tAncFMO1–5 et tAncFMO1–4 a été modélisée à l'aide d'AlphaFold230 en utilisant les paramètres casp14/full_dbs. De plus, des modèles structurels ont été obtenus en utilisant YASARA29 et 6SEK comme modèle. Ceux-ci contenaient les cofacteurs FAD et NADPH sur le site actif. Les structures ont été inspectées avec ChimeraX 1.2.5 et PyMOL 2.5.2. pour rationaliser les mutations qui pourraient être bénéfiques pour introduire l'oxydation de Baeyer-Villiger. Les résidus ont été classés en trois groupes selon qu'ils étaient présents dans les domaines de liaison FAD et NADPH, ou dans l'insertion de 80 résidus qui s'était précédemment révélée fondamentale pour la formation de tunnels de substrat. Une fois catégorisés, les résidus ont été classés comme «surface» ou «noyau» (Fig. 12 supplémentaire). Cette étape a permis d'éliminer rapidement les résidus qui n'ont probablement joué aucun rôle dans la modification de la fonction. Tous les résidus restants ont été conservés et évalués en utilisant la stratégie de mutation inverse susmentionnée.

Les cellules Escherichia coli NEB10β (Cat. # C3019I), DpnI (Cat. # R0176L) et BsaI-HF V2 (Cat. # R3733S) provenaient de New England Biolabs. L'ADN ligase T4 (Cat. # EL0013) a été commandée auprès de Thermo Fisher Scientific. Le NADPH (Cat. # 44335000) a été commandé auprès d'Oriental Yeast Co. Le N-oxyde de tamoxifène (Cat. # FT27997) et le N-oxyde de benzydamine (Cat. # FB18263) ont été achetés auprès de Biosynth et tous les autres produits chimiques provenaient de Sigma-Aldrich.

Des gènes synthétiques contenant des sites de restriction BsaI aux extrémités 5 'et 3' ont été commandés auprès de Twist Bioscience ou d'Integrated DNA Technology (IDT) pour les tAncFMO : 1–3, 1–4, 1–5, 5 et les variantes 4 ×, 4 × ', 12 × et 16 ×, respectivement. Les gènes lyophilisés ont été remis en suspension à une concentration finale de 10 ng µl-1 dans du Tris-HCl 10 mM stérile, pH 8,0. Tous les gènes tAncFMO ont été clonés selon la méthode de clonage Golden Gate. Le vecteur receveur était un plasmide pBAD modifié de telle sorte que la protéine cible soit exprimée fusionnée à son extrémité N-terminale à une protéine N-6xHis-tag-SUMO. Le mélange de clonage était le suivant : 55,4 ng d'insert tAncFMOs, 75 ng de vecteur d'entrée Golden Gate (un rapport molaire de 2:1 insert : vecteur), 15 U BsaI-HF V2, 15 U T4 DNA ligase, T4 DNA ligase buffer (1×), et de l'eau sans nucléase ajoutée à un volume final de 20 μl. Un contrôle négatif a été préparé sans aucun insert et les cycles de PCR étaient les suivants : la première étape avec un cycle à 37 °C pendant 1 h a été suivie de 55 °C pendant 10 min. Ensuite, la température a été fixée à 65°C pendant 20 min et maintenue à 8°C. Une fois clonés, les plasmides pBAD-6xHis-SUMO-tAncFMO ont été transformés dans des cellules E. coli NEB10β compétentes en CaCl2. 5,0 ul d'ADN plasmidique ont été ajoutés à 100 ul de cellules compétentes au CaCl2 et incubés pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été soumises à un choc thermique à 42 °C pendant 30 secondes et incubées sur de la glace pendant 5 minutes. 500 μl de LB-SOC ont été ajoutés pour permettre aux cellules de récupérer à 37 ° C pendant 1 h. Le culot de cellules remis en suspension a ensuite été étalé sur LB-agar contenant 100 μg ml-1 d'ampicilline et incubé pendant une nuit à 37 ° C. Les plasmides ont été purifiés et vérifiés par séquençage. Vingt pour cent des stocks de glycérol ont été stockés à -70 ° C.

Un pré-inoculum de 4 ml de LB-amp (50 μg ml-1) a été cultivé pendant une nuit à 37 °C et utilisé pour inoculer des flacons à chicanes de 2 l contenant 400 ml de milieu Terrific-Broth, additionné de 50 mg l-1 d'ampicilline et incubé à 37 °C. L'expression a été induite en ajoutant 0,02 % de L-arabinose à partir d'un stock stérile à 20 % (p/v) lorsque la DO600 était comprise entre 0,2 et 0,5. Les cultures ont été cultivées à 24 ° C sous agitation pendant un total de 30 h avant la récolte. Les cellules ont été récoltées par centrifugation (2755 g, 25 min). Les culots ont été remis en suspension dans le tampon A (NaCl 250 mM, phosphate de potassium 50 mM, pH 7, 5) avec un rapport de 5: 1 [volume (ml): masse (g)] et additionnés de fluorure de phénylméthylsulfonyle 0, 10 mM et de β-mercaptoéthanol 1, 0 mM. La rupture cellulaire a été effectuée par sonication (amplitude de 70 %, 5 s ON, 5 s OFF, pour un total de 20 min). Après centrifugation à 19 500 g pendant 20 min, le surnageant a été retiré et le culot a été remis en suspension dans le tampon A2 (NaCl 250 mM, 50 mM de phosphate de potassium, 0,5% Tritontm X-100, Phriad 7,5) (tritontm x-100 réduit, Cat. # X100RS-25G, SIGMA-ALDRICH). Le culot remis en suspension a été mélangé pendant une nuit à 4 ° C afin de solubiliser les protéines membranaires et centrifugé à 19 500 g pour recueillir le surnageant. Les tAncFMO ont été purifiés avec une résine de chromatographie d'affinité sur ions métalliques (Cat. # 17-5318-02, Cytiva). L'extrait acellulaire a été appliqué sur la colonne et lavé avec des concentrations croissantes d'imidazole. Le tampon B contenait (250 mM de NaCl, 50 mM de phosphate de potassium, 300 mM d'imidazole, 0,5 % de TritonTm X-100 réduit, pH 7,5). Après les étapes de lavage avec 0, 25 et 50 mM d'imidazole, la protéine a finalement été éluée avec 300 mM d'imidazole. Le tampon d'élution a été remplacé par un tampon de stockage (NaCl 250 mM, phosphate de potassium 50 mM, 0,05 % TritonTm X-100 réduit, pH 7,5) à l'aide d'une colonne de dessalage HiPrep 26/10 (Cat. # 17-0851-01, Cytiva).

Les enzymes étiquetées 6xHis-SUMO purifiées ont été congelées avec de l'azote liquide et conservées à -70 ° C. Des expériences ont été réalisées en utilisant ces aliquotes. Les concentrations de tAncFMO ont été déterminées à partir d'échantillons congelés qui ont été décongelés à température ambiante puis incubés à 95 ° C, centrifugés et le surnageant analysé sur un spectrophotomètre Jasco V-660. En utilisant εFAD = 11,3 mM-1 cm-1 à 450 nm, la quantité d'holoenzyme a été quantifiée et considérée comme la même pour les autres aliquotes respectives.

Pour la mutagenèse dirigée, un mélange de réaction PCR a été préparé avec 10 µM d'amorce, sens et sens, 100 ng d'ADN matrice, 1,6 % de DMSO, 0,8 mM de MgCl2 et 1 × Pfu Ultra II Hotstart Master Mix (Cat. # 600850, Agilent). Le cycle Quick Change PCR a été réalisé selon la méthode suivante : d'abord une incubation de 5 min à 95 °C, puis les cycles (95 °C pendant 5 min, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 6 min) ont été répétés 25 fois ; suivi de 72 ° C pendant 10 min et finition avec 8 ° C en attente. Le mélange de PCR a été digéré avec DpnI pendant une nuit et transformé dans des cellules compétentes de E. coli CaCl2. Des mutations ultérieures ont été effectuées en utilisant les mutants précédemment obtenus. Les amorces suivantes ont été utilisées : T60I Fw 5′-GCGCGCATCAATCTATAAAAGTGTAATTATAAACACGAGCAAAGAG-3′

& Rv 5′-CTCTTTGCTCGTGTTTATAATTACACTTTTATAGATTGATGGCGCGC-3′ ;

N222S Fw 5′-GGGAAGCTGGGTCCTGAATCGGGTATCG-3′ &

Rv 5′-CGATACCCGATTCAGGACCCAGCTTCC-3′ ;

N275H Fw 5′-CTACGGATTAGTGCCTCAACATAGAATCCTTTCCCAACA-3′

& Rv 5′-TGTTGGGAAAGGATTCTATGTTGAGGCACTAATCCGTAG-3′ ;

N462H Fw 5′-GGTTTGTTACGAGTCAGCGTCATACCATTCAAACGGATTAT-3′ &

Rv 5′-ATAATCCGTTTGAATGGTATGACGCTGACTCGTAACAAACC-3′

Pour évaluer l'activité d'oxydation du S, les thioéthers aromatiques méthyl-p-tolyl sulfure sulfure (Cat. # 275956-5G, Sigma-Aldrich) et le volumineux sulfure de benzyle phényle (Cat. # 8415660025, Sigma-Aldrich) ont été testés52,53. Pour l'activité d'oxydation de N, la benzydamine (Cat. # B5524-5G, Sigma-Aldrich) et le tamoxifène (Cat. # T5648-1G, Sigma-Aldrich) ont été sélectionnés54,55. Pour suivre l'activité BV, l'hepta-2-one aliphatique (Cat. # 537683-100 ML, Sigma-Aldrich), la cyclohexanone alicyclique (Cat. # 29140-100 ML, Sigma-Aldrich) et la phénylacétone aromatique (Cat. # 135380-100G, Sigma-Aldrich) ont été sélectionnées56,57.

Les conversions de substrat ont été effectuées en double, en utilisant un substrat de 1,0 à 5,0 mM (1% de méthanol), du NADPH 0,10 mM, une enzyme 2,0 µM, une phosphite déshydrogénase 5,0 µM (PTDH, produite en interne58) et du phosphite de sodium 20 mM. Les deux derniers composants ont été utilisés comme système de régénération pour le NADPH et le contrôle ne contenait pas de tAncFMO. Tous les composés ont été préparés dans un tampon de stockage (50 mM KPi, 250 mM NaCl, 0,05 % TritonTm X-100 réduit, pH 7,5). Le volume réactionnel final a été ajusté à 1,0 ml et mis dans des flacons de 4 ml avant d'être incubé à 30 °C, sous agitation, pendant 16 h. Les conversions de phénylacétone, d'heptan-2-one, de cyclohexanone, de sulfure de benzylphényle et de sulfure de méthyl-p-tolyle ont été analysées par GC – MS tandis que les conversions de benzydamine et de tamoxifène ont été surveillées par HPLC. En raison de leur faible solubilité, les conversions de tamoxifène, de benzydamine et de sulfure de benzylphényle ont été effectuées en utilisant un substrat de 1,0 mM tandis que les substrats restants ont été testés à 5,0 mM.

Pour l'analyse GC-MS, les composés ont été extraits en ajoutant un volume d'acétate d'éthyle avec 0,02 % (v/v) de mésitylène comme étalon interne. Les échantillons ont été vortexés pendant 20 s, centrifugés et la phase organique a été éluée à travers du sulfate de magnésium anhydre. Les analyses GC-MS ont été réalisées dans un appareil GCMS-QP2010 Ultra (SHIMADZU) à l'aide d'une colonne HP-1 et HP-5 ms Agilent (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). La méthode était la suivante : température de l'injecteur et du détecteur à 250 °C, un rapport de division de 5,0 et un volume d'injection de 1 μl. La température de la colonne a été maintenue à 50°C pendant 4 min, augmentée de 10°C/min à 250°C et maintenue pendant 5 min. Les temps de rétention des substrats et des produits sont affichés dans les informations complémentaires (tableau S3) avec les spectres de masse correspondants. Les conversions ont été calculées sur la base de l'épuisement du substrat et normalisées avec l'étalon interne.

Les analyses HPLC ont été effectuées après dilution de 300 μl de l'échantillon dans 1200 μl d'acétonitrile, vortex pendant 20 s et centrifugation. L'analyse du surnageant a été réalisée par HPLC en phase inverse. Les échantillons ont été injectés avec un volume de 10 μl sur un système HPLC JASCO AS2051 Plus, équipé d'une colonne Grace Alltima HP C18 (5 μm, 4,6 × 250 mm). Les solvants utilisés sont de l'eau avec 0,1% v/v d'acide formique (A) et d'acétonitrile (B) et le débit est de 0,8 ml.min-1. Pour la benzydamine, la méthode correspondait à 8 min sur un flux isocratique de 35 % B et 65 % A. La benzydamine et le N-oxyde de benzydamine ont été détectés à 308 nm avec un temps de rétention de 5,3 min et 5,7 min, respectivement. Pour le tamoxifène la méthode était la suivante : 30 min sur un gradient de 40–95% B, 3 min avec 95% B suivi d'un gradient diminué de 5 min de 95–40% B et enfin un rééquilibrage de 2 min. Le tamoxifène et le N-oxyde de tamoxifène ont été détectés à 276 nm avec un temps de rétention de 10,5 min et 11,7 min, respectivement. L'identité des deux produits a été confirmée en utilisant les normes correspondantes et la conversion calculée sur la base de l'épuisement du substrat.

Afin d'observer la formation de C4a-(hydro)peroxyflavine, nous avons effectué des expériences à flux arrêté à l'aide du spectromètre à flux arrêté SX20 équipé soit du détecteur à barrette de photodiodes, soit du module de tubes photomultiplicateurs (PMT) (Applied Photophysics, Surrey, Royaume-Uni). Les résultats ont été obtenus en mélangeant 50 μl de deux solutions en mode de mélange unique. Toutes les solutions ont été préparées dans 50 mM de phosphate de potassium, 250 mM de NaCl et 0,05 % de TritonTm X-100 réduit, pH 7,5 à 25 °C. Pour chaque réaction, une concentration d'enzyme de 8 à 15 μM a été utilisée et les mesures ont été effectuées en triple exemplaire technique. Au besoin, les solutions ont été additionnées de glucose 5,0 mM. Les solutions enzymatiques ont été rendues anaérobies en rinçant les solutions pendant 10 min avec de l'azote, puis en ajoutant 0, 3 μM de glucose oxydase (Aspergillus niger, type VII, Cat. # G2133-50KU, Sigma-Aldrich) pour consommer l'oxygène restant. Afin de réduire le cofacteur flavine dans les tAncFMO, 1 à 1,2 équivalent de NADPH a été ajouté à la solution enzymatique. La solution résultante a été incubée sur de la glace jusqu'à ce que le blanchiment du FAD soit complet, indiquant une réduction complète en FADH2. Pour déterminer les taux de formation intermédiaire, les enzymes réduites ont été mélangées avec des tampons contenant différentes concentrations de dioxygène. Les concentrations finales de dioxygène (0,13, 0,31, 0,61, 0,96 mM après mélange) ont été obtenues en mélangeant la solution enzymatique anaérobie avec (1) un tampon saturé d'air ; (2) des volumes égaux de tampon 100 % argon et de tampon 100 % O2 ; (3) tampon 100 % O2 ; (4) Tampon 100 % O2 sur glace. Toutes les solutions ont été mises à barboter pendant 10 min à température ambiante, sauf la dernière qui a été faite sur de la glace. Les taux observés (kobs) ont été déterminés en ajustant les traces aux fonctions exponentielles. Toutes les données ont été analysées à l'aide des logiciels Pro-Data Viewer v4.2.12, Pro-Kineticist v1.0.13 (Applied Photophysics, Surrey, UK) et GraphPad Prism 6.05 (La Jolla, CA, USA).

Des essais de cinétique à l'état d'équilibre ont été effectués en triple exemplaire technique sur un spectrophotomètre Jasco V-660. L'activité enzymatique des protéines ancestrales a été mesurée en surveillant la consommation de NADPH (absorbance à 340 nm, ε340 = 6,22 mM-1 cm-1 pour NADPH). Le tampon utilisé pour les analyses cinétiques était 50 mM de phosphate de potassium, 250 mM de NaCl, 0,05 % de TritonTm X-100 réduit, pH 7,5. Le spectrophotomètre a été réglé à 25°C et la réaction a été démarrée en ajoutant l'enzyme. Pour la détermination KM des substrats, 100 μM de NAD(P)H ont été utilisés. Les taux de découplage du NAD(P)H ont été déterminés en l'absence de substrats en double.

L'affinité pour l'oxygène a été déterminée à l'aide du système d'électrodes à oxygène The Oxygraph+ (Hansatech Instruments Ltd., Royaume-Uni). La consommation d'oxygène a été contrôlée après que les enzymes (concentration allant de 3 à 12 μM) aient été mélangées avec un tampon saturé d'air contenant le cofacteur NADPH et un substrat. Toutes les mesures ont été faites en double. À température ambiante, l'eau saturée en air contient environ 0,2 mM d'oxygène. Par conséquent, un excès de cofacteur NADPH (0, 6 mM) et de substrat (sulfure de méthyl-p-tolyle ou phénylacétone, 2, 5 mM) a été ajouté au mélange réactionnel pour garantir que la concentration en oxygène sera le seul facteur affectant les valeurs de kobs. Lorsque l'oxygène était complètement épuisé, la mesure était terminée. Les valeurs de kobs ont été calculées par le logiciel OxyTrace+ Windows® (Hansatech Instruments Ltd., UK).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les séquences ancestrales (tAncFMO) générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Genbank sous les codes d'accession : OP381052 (tAncFMO1–5), OP381053 (tAncFMO5), OP381054 (tAncFMO1–4) et OP381055 (tAncFMO1–3). Les données expérimentales générées dans cette étude sont fournies dans le fichier Informations supplémentaires/Données source. L'ensemble de données collectées pour l'analyse phylogénétique est fourni dans les informations supplémentaires. Les relations taxonomiques et les données d'échelle de temps évolutives utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de connaissances TimeTree 5 [http://www.timetree.org/]. Les images de silhouettes d'organismes utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de données PhyloPic [http://www.phylopic.org/]. Les données structurelles utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de données PDB sous les codes d'accès : 6SEK (mAncFMO5) et 6SF0 (mAncFMO2). Les données de séquence utilisées dans cette étude sont disponibles dans la base de données Genbank sous les codes d'accession : OP381050 (mAncFMO1), OP381047 (mAncFMO2), OP381048 (mAncFMO3–6) et OP381049 (mAncFMO5). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions le Dr Hein Wijma d'avoir fourni les modèles AlphaFold et d'avoir effectué les expériences d'amarrage. Nous remercions le Dr Walter Lapadula pour les discussions sur l'histoire évolutive des FMO. Ce travail a été financé par : le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 847675, le projet COFUND oLife (MLM), le programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 722390 (GB) et la Fondazione Cariplo n° 2020-0894 (AM et MWF).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Gautier Bailleul, Guang Yang.

Groupe d'enzymologie moléculaire, Université de Groningen, Groningen, Pays-Bas

Gautier Bailleul, Guang Yang, Marco W. Fraaije & Maria Laura Mascotti

Département de Biologie et Biotechnologie "Lazzaro Spallanzani", Université de Pavie, Pavie, Italie

Callum R. Nicoll & Andrea Mattevi

IMIBIO-SL CONICET, Faculté de chimie biochimique et de pharmacie, Université nationale de San Luis, San Luis, Argentine

Maria Laura Mascotti

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Tous les auteurs répertoriés ont réalisé des expériences et/ou analysé des données. GB et CRN ont établi les protocoles de purification et d'expression, effectué l'analyse évolutive et la reconstruction de la séquence ancestrale sous la direction du MLM. GB a réalisé toutes les expériences de clonage, de mutagenèse et de conversion. GB et GY ont produit les enzymes et effectué la cinétique à l'état d'équilibre. GY a réalisé les expériences d'affinité à flux arrêté et à l'oxygène. CRN a généré les modèles structurels et effectué l'analyse mécaniste structurelle. GY, GB, CRN et MLM ont préparé les chiffres. MLM a rédigé l'article et CRN, AM et MWF l'ont édité. Tous les auteurs ont fourni des commentaires critiques et ont contribué à façonner la recherche, l'analyse et l'article. MLM a conçu l'idée originale avec le soutien d'AM et de MWF.

Correspondance à Maria Laura Mascotti.

Tous les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Bailleul, G., Yang, G., Nicoll, CR et al. Évolution de la fonctionnalité enzymatique dans les monooxygénases contenant de la flavine. Nat Commun 14, 1042 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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Reçu : 14 septembre 2022

Accepté : 15 février 2023

Publié: 24 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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