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Oct 27, 2023

Analyses structurales et fonctionnelles de la protéine conférant la résistance à l'échinomycine Ecm16 de Streptomyces lasalocidi

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7980 (2023) Citer cet article

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L'échinomycine est un antibiotique naturel bisintercalateur d'ADN. Le groupe de gènes biosynthétiques de l'échinomycine chez Streptomyces lasalocidi comprend un gène codant pour la protéine d'autorésistance Ecm16. Ici, nous présentons la structure cristalline de résolution de 2,0 Å d'Ecm16 liée à l'adénosine diphosphate. La structure d'Ecm16 ressemble étroitement à celle d'UvrA, le composant capteur de dommages à l'ADN du système de réparation par excision de nucléotides procaryotes, mais Ecm16 n'a pas le domaine de liaison UvrB et son module de liaison au zinc associé trouvé dans UvrA. L'étude de mutagenèse a révélé que le domaine d'insertion d'Ecm16 est nécessaire pour la liaison à l'ADN. De plus, la séquence d'acides aminés spécifique du domaine d'insertion permet à Ecm16 de distinguer l'ADN lié à l'échinomycine de l'ADN normal et de lier la liaison du substrat à l'activité d'hydrolyse de l'ATP. L'expression d'ecm16 chez l'hôte hétérologue Brevibacillus choshinensis a conféré une résistance à l'échinomycine et à d'autres antibiotiques quinomycines, notamment la thiocoraline, la quinaldopeptine et la sandramycine. Notre étude fournit de nouvelles informations sur la manière dont les producteurs d'antibiotiques bisintercalateurs d'ADN repoussent les composés toxiques qu'ils produisent.

Les antibiotiques à base de quinomycine agissent en se liant de manière non covalente à la double hélice d'ADN1. Ce sont des bisintercalateurs d'ADN, des composés qui se lient de manière réversible au duplex d'ADN en insérant une paire de groupes cycliques aromatiques entre les paires de bases adjacentes de l'ADN. Il y a eu beaucoup d'intérêt pour cette famille de composés en raison de leur puissante activité antimicrobienne et antitumorale, aboutissant à un grand nombre de connaissances biochimiques, structurelles et cliniques2. Cependant, les détails mécanistes sur la résistance bactérienne contre les bisintercalateurs d'ADN restent limités. Bien qu'aucun élément de résistance contre ces composés n'ait été découvert à ce jour chez les bactéries pathogènes, il est prudent d'identifier et d'élucider les mécanismes de résistance présents dans le milieu naturel. La connaissance des mécanismes de résistance de base permettra aux chercheurs de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques avant que la résistance à la quinomycine ne devienne un problème clinique.

Les producteurs d'antibiotiques à base de quinomycine contiennent généralement un ou plusieurs gènes d'autorésistance, qui se trouvent soit dans le groupe de gènes biosynthétiques de l'antibiotique, soit ailleurs dans le génome. Par exemple, la bactérie productrice de triostine contient un gène qui code pour un transporteur ABC3, et le producteur de thiocoraline contient des gènes qui codent pour un transporteur ABC ainsi qu'une protéine de séquestration de la thiocoraline4,5. Fait intéressant, les producteurs de quinomycine contiennent également un gène pour un UvrA -like protein dans leur groupe de gènes biosynthétiques (tableau 1). UvrA est une enzyme de réparation de l'ADN issue de la voie universelle de réparation par excision de nucléotides procaryotes (NER). En bref, UvrA reconnaît les dommages à l'ADN et recrute UvrB sur le site de la lésion. UvrB recrute UvrC qui clive la liaison phosphodiester huit nucléotides en amont et jusqu'à cinq nucléotides en aval du nucléotide modifié. Ensuite, UvrC recrute l'hélicase UvrD qui déplace le fragment d'ADN clivé. L'ADN polymérase I synthétise le segment d'ADN manquant en utilisant le brin complémentaire non endommagé comme matrice et l'ADN ligase scelle les cassures, complétant ainsi la réparation6.

L'échinomycine est un bisintercalateur d'ADN prototypique produit par plusieurs actinomycètes, dont Streptomyces echinatus et Streptomyces lasalocidi (anciennement connu sous le nom de S. lasaliensis)7,8,9. C'est un depsipeptide cyclique qui contient deux groupes quinoxalines et un pont thioacétal inhabituel (Fig. 3)10. L'échinomycine présente une activité antimicrobienne puissante contre le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline et les entérocoques résistants à la vancomycine11,12, mais elle n'est pas utilisée en clinique en raison de problèmes de solubilité et de toxicité. Le groupe de gènes biosynthétiques de l'échinomycine de S. lasalocidi contient des gènes qui codent pour des enzymes qui synthétisent le groupe quinoxaline, des enzymes qui construisent le squelette peptidique et des gènes qui codent pour des protéines de fonction inconnue13. L'une des protéines fonctionnellement non caractérisées est Ecm16, qui a été postulée pour fournir une autoprotection contre l'échinomycine basée sur l'identité de séquence (~ 30%) qu'elle partage avec les protéines procaryotes UvrA qui fonctionnent dans la voie NER13.

Nous avons précédemment rapporté la caractérisation fonctionnelle in vivo et in vitro de Ecm1614. Les principaux résultats de cette étude sont (1) l'Escherichia coli K12 sensible à l'échinomycine devient résistant à l'échinomycine lors de la transformation avec le plasmide codant pour ecm16, (2) Ecm16 ne nécessite pas la participation des protéines NER UvrA, UvrB, UvrC ou UvrD pour fournir de l'échinomycine résistance, (3) Ecm16 ne complète pas la fonction UvrA, (4) l'activité ATPase d'Ecm16 est essentielle pour son activité anti-échinomycine, (5) Ecm16 se lie à l'ADN double brin d'une manière indépendante de la séquence nucléotidique, et (6) Ecm16 se lie à l'ADN contenant de l'échinomycine ~ deux fois plus fortement qu'à l'ADN sans échinomycine. Dans l'étude actuelle, nous avons déterminé la structure cristalline d'Ecm16 pour fournir un contexte structurel à sa fonction. Nous avons également réalisé des études mutationnelles pour disséquer le rôle du domaine d'insertion d'Ecm16. Dans les protéines UVrA, le domaine d'insertion est impliqué dans la liaison à l'ADN spécifique aux dommages15. Enfin, nous avons sondé la spécificité de substrat d'Ecm16 en défiant les cellules exprimant ecm16 avec une série d'antibiotiques ciblant l'ADN quinomycine et non-quinomycine.

Nous avons déterminé la structure d'Ecm16 liée à l'adénosine diphosphate (ADP) à une résolution de 2, 0 Å (Fig. 1a). Notre modèle final se compose de l'homodimère Ecm16, quatre ADP, deux Mg2+, quatre Zn2+ et 612 molécules d'eau (tableau 2). Certains résidus, dont 183-293 de la chaîne A et 185-295 de la chaîne B qui comprend l'ensemble du domaine d'insertion, n'ont pas été modélisés en raison d'une densité électronique manquante (tableau supplémentaire 1). Chaque protomère d'Ecm16 contient deux motifs ABC ATPase, appelés domaines de liaison aux nucléotides I et II (NBD-I et NBD-II). NBD-I se compose du domaine I de liaison à l'ATP, du domaine I de signature et du domaine d'insertion. Le domaine d'insertion n'était pas visible dans la structure cristalline, probablement parce qu'il est désordonné. NBD-II se compose du domaine II de liaison à l'ATP et du domaine II de signature. NBD-II manque le brin d'hélice qui correspond au résidu 66-99 de NBD-I (Fig. 1 supplémentaire). Outre ces deux différences, NBD-I et NBD-II ont une structure globale relativement similaire (RMSD = 1,5 Å pour 208 atomes Cα). L'interface dimère d'Ecm16 enterre ~ 3900 Å2 de surface et est composée de résidus des domaines de liaison à l'ATP I, signature I et signature II (Fig. 2 supplémentaire). La face ventrale d'Ecm16 présente une rainure étendue bordée de nombreux résidus basiques (K136, K143, K381, R384, R567, K568, R537, K549, K572, K577) (Fig. 3 supplémentaire). Cette rainure d'environ 10 nm de long et d'environ 2 nm de large peut potentiellement accueillir un ADN de forme B d'environ 32 pb et fournit une base structurelle pour l'activité de liaison à l'ADN précédemment rapportée d'Ecm1614.

Structure cristalline de Ecm16. ( a ) Organisation du domaine et structure globale de l'homodimère Ecm16. Le domaine d'insertion est présent dans la structure primaire, mais il n'est pas observé dans la structure cristalline. Les atomes ADP, Zn2+ et Mg2+ sont dessinés sous forme de sphères (C : jaune, N : bleu, O : rouge, P : orange, Zn : gris, Mg : vert). ( b ) Site de liaison aux nucléotides proximal. Les distances atome à atome sont données en Å. ( c ) Site de liaison aux nucléotides distal. (d) En haut : module de liaison au zinc 2. En bas : module de liaison au zinc 3. (e) Structure cristalline de Ecm16 de Streptomyces lasalocidi (PDB ID : 7SH1), UvrA de Bacillus stearothermophilus (PDB ID : 2R6F) et UvrA2 de Deinococcus radiodurans (APB ID : 2VF8).

Ecm16 a un total de quatre sites de liaison aux nucléotides, deux sites de liaison aux nucléotides proximaux et deux distaux (Fig. 1a). Le site proximal de liaison aux nucléotides est situé à environ 19 Å de l'interface du dimère Ecm16 et il est pris en sandwich entre le domaine I de liaison à l'ATP et le domaine de signature II. Le site distal de liaison aux nucléotides est situé à environ 26 Å de l'interface du dimère et il est pris en sandwich entre le domaine de liaison à l'ATP II et le domaine de signature I. Chaque domaine de liaison à l'ATP contient un motif Walker A, un motif Walker B et le α-hélicoïdal Sous-domaine de signature ABC contenant la séquence LSGGQ généralement présente dans les transporteurs ABC16 et les protéines de réparation de l'ADN17. Les domaines de liaison à l'ATP et de signature sont reliés par la boucle Q, qui est le site d'un changement conformationnel majeur et du couplage des domaines de conversion d'énergie de NBD sur d'autres ATPases18. La densité électronique aux sites de liaison des nucléotides proximaux et distaux a montré la présence d'ADP (Fig. 4 supplémentaire). Pour confirmer davantage l'identité du nucléotide lié à Ecm16, nous avons effectué une analyse par chromatographie liquide de l'extrait protéique. Seul l'ADP a été détecté dans cette expérience (Fig. 5 supplémentaire), ce qui indique que le nucléotide observé dans la structure cristalline d'Ecm16 est l'ADP et non l'ATP.

Les ions Mg2+ ne sont observés qu'aux deux sites proximaux de liaison aux nucléotides, et non aux sites distaux, même si Ecm16 a été cristallisé en présence de 10 mM de MgCl2 (Fig. 1b, c). La raison n'est pas claire, mais une observation similaire a été faite pour la structure cristalline d'UvrA de Bacillus stearothermophilus19. Les groupes phosphate de l'ADP participent à un vaste réseau de liaisons hydrogène impliquant les résidus du motif Walker A, tandis que le sucre ribose et la base adénine forment relativement peu d'interactions avec Ecm16. Le résidu histidine conservé en position 501 s'empile bien contre le cycle adénine de l'ADP au niveau du site distal. Chaque protomère Ecm16 contient deux modules de liaison au zinc, qui correspondent aux modules de liaison au zinc UvrA 2 et 3 observés dans toutes les structures cristallines UvrA rapportées jusqu'à présent. Dans le module 2, Zn2+ est coordonné à C176, C179, C296 et C299, tandis que dans le module 3, Zn2+ est coordonné à C589, C592, C612 et C615 (Fig. 1d). Ces résidus de coordination du zinc sont conservés dans les protéines UvrA et UvrA214,15.

La structure tridimensionnelle d'Ecm16 ressemble à celle d'UvrA de B. stearothermophilus (RMSD = 2,6 Å pour 1002 atomes Cα) et d'UvrA2 de Deinococcus radiodurans (RMSD = 1,7 Å pour 933 atomes Cα) (Fig. 1e, Fig. 6 supplémentaire) . La similitude structurelle de Ecm16, UvrA et UvrA2 explique leurs fonctionnalités communes telles que la liaison à l'ADN et l'hydrolyse de l'ATP15,20. Cependant, Ecm16, comme UvrA2, n'a pas le domaine de liaison UvrB et son module de liaison au zinc associé 1 qui se trouvent dans toutes les protéines UvrA, indiquant que Ecm16 n'interagit pas avec UvrB de la voie NER. Ceci est cohérent avec notre rapport précédent selon lequel les souches knock-out de type sauvage et UvrB d'E. coli K12 sont devenues résistantes à l'échinomycine lors de l'induction de l'expression de ecm16 codé en trans14.

Il a été proposé que le domaine d'insertion d'UvrA et d'UvrA2 contribue à la liaison du substrat d'ADN15,20,21. Pour tester si le domaine d'insertion d'Ecm16 est requis pour la liaison à l'ADN, nous avons préparé Ecm16-ΔID dans lequel le domaine d'insertion a été remplacé par un lieur glycine-sérine (Figs. 7, 8 supplémentaires). Nous avons surveillé la liaison d'Ecm16 et d'Ecm16-ΔID à un ADN de 32 pb contenant un seul site de liaison à l'échinomycine (tableau supplémentaire 2). Le test de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) a montré qu'Ecm16 se liait plus étroitement à l'ADN lié à l'échinomycine qu'à l'ADN normal, alors que Ecm16-ΔID ne se liait à aucun type d'ADN (Fig. 2a). Ensuite, nous avons mesuré l'affinité de liaison à l'ADN de Ecm16 et Ecm16-ΔID en utilisant la polarisation de fluorescence. La constante de dissociation pour Ecm16-DNA-échinomycine et Ecm16-DNA était de 11, 8 nM et 60, 2 nM, respectivement (Fig. 2b, Tableau 3). Pour Ecm16-ΔID, aucune liaison n'a été observée pour l'un ou l'autre substrat d'ADN. Par conséquent, l'EMSA et la polarisation de fluorescence ont toutes deux montré que le domaine d'insertion d'Ecm16 est requis pour la liaison à l'ADN.

Le domaine d'insertion d'Ecm16 est requis pour la résistance à l'échinomycine. ( a ) Activité de liaison à l'ADN des protéines Ecm16 de type sauvage et variantes analysées à l'aide d'un test de décalage de mobilité électrophorétique. Le mélange réactionnel contenait de l'ADN ou de l'ADN-échinomycine (marqué par un astérisque) en l'absence (pistes 1 et 2) ou en présence de 100, 200 et 300 nM d'Ecm16, Ecm16-ΔID et Ecm16*. Les gels originaux sont présentés dans la Fig. 9 supplémentaire. (b) Activité de liaison à l'ADN des protéines Ecm16 de type sauvage et variantes analysées à l'aide d'un test de polarisation de fluorescence. 50 nM d'ADN de 32 pb marqués à la fluorescéine (en haut) et 50 nM d'ADN d'échinomycine (en bas) ont été incubés avec des quantités croissantes de protéines. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois expériences indépendantes. ( c ) Activité d'hydrolyse spécifique de l'ATP d'Ecm16, Ecm16 * et UvrA en présence d'ADN 1 µM, d'ADN-échinomycine, d'ADN-fluorescéine et d'ADN-doxorubicine. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois expériences indépendantes. (d) Détermination de la résistance à l'échinomycine. Courbe de croissance des cellules E. coli (K12) portant les plasmides p(VCO), p(ecm16), p(ecm16-ΔID) et p(ecm16*) en l'absence ou en présence d'échinomycine 10 µM . Les parcelles sont représentatives de trois répétitions indépendantes.

Ensuite, nous avons préparé Ecm16 * dans lequel le domaine d'insertion d'Ecm16 a été échangé avec le domaine d'insertion de DrrC, un homologue d'Ecm16 de Streptomyces peucetius (Figs. 7, 8 supplémentaires). Il a été rapporté que DrrC conférait une résistance contre la daunorubicine, un antibiotique monointercalateur d'ADN, bien que le mécanisme moléculaire de DrrC ne soit pas connu22. Le domaine d'insertion de Ecm16 et DrrC partagent 32 % d'identité de séquence d'acides aminés. Ecm16* s'est lié à l'ADN contenant de l'échinomycine 2,4 fois plus étroitement qu'à l'ADN normal (KD = 37,7 nM contre 90,8 nM) (Fig. 2b, Tableau 3). Ce résultat indique que le fait d'avoir un domaine d'insertion homologue est suffisant pour qu'Ecm16 distingue l'ADN lié à l'échinomycine de l'ADN normal par liaison différentielle. Pour déterminer si Ecm16* a une activité anti-échinomycine, des cellules E. coli K12 exprimant Ecm16* ont été provoquées avec 10 µM d'échinomycine. Les cellules exprimant Ecm16 * étaient sensibles à l'échinomycine (Fig. 2d), ce qui indique que le domaine d'insertion natif doit être présent pour fournir une activité anti-échinomycine.

Nous avons signalé précédemment que l'activité d'hydrolyse de l'ATP d'Ecm16 est nécessaire pour rendre la résistance à l'échinomycine in vivo14. Étant donné que Ecm16* se liait préférentiellement à l'ADN contenant de l'échinomycine, mais qu'il ne conférait pas de résistance à l'échinomycine, nous avons prédit qu'Ecm16* ne pouvait pas hydrolyser l'ATP. Pour tester cette idée, nous avons mesuré l'activité d'hydrolyse de l'ATP de Ecm16, Ecm16-ΔID, Ecm16 * et UvrA en présence d'ADN sans médicament, d'ADN lié à l'échinomycine, d'ADN modifié à la fluorescéine et d'ADN lié à la doxorubicine (tableau supplémentaire 2). L'ADN lié à l'échinomycine est le substrat natif présumé d'Ecm16, l'ADN modifié par la fluorescéine imite l'ADN endommagé par les UV et est un substrat connu pour l'UvrA mais pas pour l'Ecm1614,20, et l'ADN lié à la doxorubicine est le substrat présumé pour le DrrC23. L'activité d'hydrolyse de l'ATP d'Ecm16 a été multipliée par 16 en présence d'ADN lié à l'échinomycine, mais pas des autres substrats d'ADN que nous avons testés (Fig. 2c). Ecm16 * et UvrA ont montré une activité ATPase basale similaire pour les quatre substrats d'ADN. Ecm16-ΔID n'a montré aucune activité significative d'hydrolyse de l'ATP pour tous les substrats d'ADN (Fig. 10 supplémentaire), ce qui est cohérent avec l'incapacité d'Ecm16ΔID à se lier à l'ADN (Fig. 2a, b). Ces résultats indiquent que seul le substrat d'ADN natif stimule l'activité d'hydrolyse de l'ATP d'Ecm16 et que cette propriété est perdue lorsque le domaine d'insertion est délété ou lorsqu'il est remplacé par le domaine d'insertion d'une protéine homologue. Par conséquent, le domaine d'insertion joue un rôle important dans la détermination de la spécificité de substrat d'Ecm16 et dans le soutien de l'activité anti-échinomycine d'Ecm16.

Nous avons sondé la spécificité de substrat d'Ecm16 en testant si Ecm16 peut fournir une résistance contre d'autres molécules médicamenteuses liant l'ADN - doxorubicine, mitomycine C, daunorubicine, actinomycine D, cisplatine, thiocoraline, quinaldopeptine et sandramycine. Comme la perméabilité de ces composés est limitée chez les bactéries Gram négatif (diderme), nous avons utilisé la bactérie Gram positif (monoderme) Brevibacillus choshinensis, au lieu de E. coli K12. Les cellules de B. choshinensis exprimant Ecm16 présentaient une résistance uniquement contre les antibiotiques bisintercalateurs d'ADN échinomycine, thiocoraline, quinaldopeptine et sandramycine (Fig. 3). Le degré de résistance fourni par Ecm16 était le plus prononcé à la plus forte concentration d'antibiotique testée. Les cellules contenant le vecteur de contrôle se sont développées très lentement en présence d'échinomycine 0,1 µM, de thiocoraline 4 µM, de quinaldopeptine 6 µM ou de sandramycine 2 µM, ce qui a rendu impossible la détermination du temps de doublement, alors que les cellules exprimant Ecm16 avaient des temps de doublement plus similaires aux cellules. qui n'ont pas été traités avec l'antibiotique respectif (seulement 1,1 à 1,2 fois plus longtemps) (Fig. 3). Notre résultat a montré qu'Ecm16 est le plus efficace contre l'échinomycine, mais qu'il offre également une certaine résistance contre d'autres antibiotiques quinomycines structurellement similaires.

Étude de la courbe de croissance des souches de B. choshinensis avec pNI vector-control-only (VCO) ou plasmide ecm16_pNI. Les cellules ont été cultivées dans du milieu 2SY additionné de 50 ug/ml d'antibiotique néomycine. La souche de B. choshinensis a été incubée avec les concentrations indiquées d'ADN d'échinomycine (0,025, 0,05, 0,1 µM), de thiocoraline (0,5, 2,0, 4,0 µM), de quinaldopeptine (1,5, 3,0, 6,0 µM) et de sandramycine (0,5, 1,0, 2,0 µM). bis-intercalateurs. Les barres d'erreur représentent l'écart type de trois expériences indépendantes.

Nous rapportons ici la structure cristalline d'Ecm16 du producteur d'échinomycine S. lasalocidi. Ecm16 est un homologue d'UvrA, la protéine capteur de dommages à l'ADN de la voie procaryote NER. La principale différence structurelle entre Ecm16 et UvrA est que Ecm16 n'a pas le domaine de liaison UvrB et un module de liaison au zinc qui sont présents dans toutes les structures UvrA signalées à ce jour (PDB ID : 2R6F, 3PIH, 3UWX, 3UX8, 3ZQJ, 6N9L). Une autre différence structurelle potentielle est la conformation du domaine d'insertion d'environ 100 résidus, bien que cela reste à vérifier car le domaine d'insertion n'est pas visible dans la structure cristalline Ecm16, probablement parce que ce domaine est mobile en l'absence d'un substrat d'ADN lié. Dans l'ensemble, la structure tridimensionnelle d'Ecm16 et d'UvrA est très similaire. Ils partagent le même repli protéique et contiennent tous deux quatre sites de liaison à l'ATP et un sillon continu de liaison à l'ADN. En conséquence, Ecm16 et UvrA affichent tous deux une activité ATPase et se lient à l'ADN14 double brin. Cependant, Ecm16 n'a pas le domaine de liaison UvrB et son module de liaison au zinc associé, ce qui suggère qu'Ecm16 et UvrA ont des mécanismes moléculaires distincts acquis potentiellement par une évolution divergente.

Ecm16ΔID, qui n'a pas le domaine d'insertion, n'a pas réussi à se lier à l'ADN. De plus, l'expression d'Ecm16ΔID dans E. coli K12 n'a pas protégé les cellules de l'échinomycine. Ecm16*, qui possède le domaine d'insertion de la protéine de résistance à la daunorubicine DrrC, a montré une affinité de liaison 2,4 fois supérieure à l'ADN lié à l'échinomycine par rapport à l'ADN normal. Cependant, Ecm16 *, contrairement à Ecm16, n'a pas affiché l'augmentation spectaculaire du taux d'hydrolyse de l'ATP en présence d'ADN contenant de l'échinomycine. Sur la base de ces résultats, nous proposons un modèle en deux étapes pour la détection de l'ADN lié à l'échinomycine par Ecm16. Dans la première étape, Ecm16 discrimine l'ADN lié à l'échinomycine de l'ADN normal par affinité différentielle de liaison à l'ADN. Cette étape de criblage initiale nécessite la présence du domaine d'insertion indépendant de la séquence. Dans la deuxième étape, les substrats d'ADN liés à Ecm16 sont en outre discriminés par leur capacité à stimuler l'activité ATPase d'Ecm16. Cette deuxième étape semble nécessiter un domaine d'insertion spécifiquement adapté à l'échinomycine. Des études structurelles supplémentaires sont nécessaires pour déterminer comment ces deux étapes sont réalisées au niveau moléculaire. En particulier, la structure atomique d'Ecm16 en complexe avec de l'ADN lié à l'échinomycine et avec de l'ADN sans échinomycine aidera à déchiffrer le mécanisme moléculaire. Fait intéressant, Ecm16 a également fourni une protection contre les bisintercalateurs d'ADN de produits naturels thiocoraline, quinaldopeptine et sandramycine. Cela rappelle la capacité de la protéine UvrA à détecter une grande variété de lésions de l'ADN.

La compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques est importante car elle permet le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos travaux ont commencé à démêler un mécanisme de résistance aux antibiotiques potentiellement nouveau, mais d'autres études sont nécessaires pour bien comprendre comment Ecm16 confère la résistance à l'échinomycine. Cela comprend la détermination de la structure d'Ecm16 liée à divers substrats d'ADN et l'identification, le cas échéant, des protéines partenaires d'Ecm16. En supposant que Ecm16 nécessite des protéines partenaires, il s'agit probablement de protéines conservées dans différentes lignées phylogénétiques, car Ecm16 confère une résistance à l'échinomycine lorsqu'elle est exprimée dans trois organismes éloignés, S. lasalocidi, E. coli et B. choshinensis.

Les souches et les plasmides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau S4. La souche E. coli DH5α (Invitrogen) a été utilisée pour le clonage et la propagation plasmidique, tandis que des études de courbe de croissance ont été réalisées à l'aide de la souche E. coli (K12) (Invitrogen). Le bouillon Luria – Bertani (LB) (Difco) avec l'antibiotique approprié a été utilisé pour faire pousser des cultures d'E. coli à 37 ° C avec une aération constante et une agitation à 200 tr / min. Les souches d'E. coli cultivées sur des milieux solides ont été étalées sur de la gélose LB (Fisher BioReagents) et incubées à 37 °C. 0,2% de l-arabinose (Alfa Aesar) a été ajouté pour l'induction de l'expression génique dans les cultures de croissance LB. La souche de B. choshinensis (Takara Bio) a été cultivée en MT (10 mg ml-1 glucose, 10 mg ml-1 phytone peptone, 35 % d'extrait de bonite ehrlich, 2 mg ml-1 extrait de levure étiquette bleue, 10 µg ml-1 FeSO4 , 10 µg ml-1 MnSO4, 1 µg ml-1 ZnSO4, 4,1 µg ml-1 MgCl2). Pour les études de courbe de croissance, la souche de B. choshinensis a été cultivée dans un milieu liquide 2SY (20 mg ml-1 glucose, 40 mg ml-1 bacto soja, 5 mg ml-1 bacto extrait de levure, 150 µg ml-1 CaCl2) à 37 ° C avec agitation à 200 rpm. Des cellules d'E. coli et de B. choshinensis hébergeant différents plasmides ont été maintenues en présence d'ampicilline (50 µg ml-1 de milieu liquide et 100 µg ml-1 de milieu solide pour E. coli) et de néomycine (50 µg ml-1 pour B. choshinensis ). Les souches de B. choshinensis ont été maintenues sous forme de cultures mères à − 80 °C. Les cultures mères ont été congelées dans du milieu LB contenant 40 % de glycérol.

Les gènes optimisés en codons pour ecm16 et ecm16-ΔID ont été sous-clonés dans le vecteur pUC19 en utilisant les sites NdeI et EcoRI (GenScript) pour l'expression dans E. coli. Les gènes ont été digérés à l'aide des enzymes Ndel et EcoRI et purifiés sur gel. Le vecteur d'expression pET28a (+) a été coupé avec Ndel et EcoRI et purifié sur gel. Les inserts ecm16 et ecm16-ΔID ont été ligaturés dans le vecteur pET28a(+) à un rapport insert/vecteur de 3:1 en utilisant le kit de ligature rapide (New England Biolabs Inc). Les produits de ligation ont été transformés dans des cellules E. coli DH5α chimiquement compétentes et cultivées pendant une nuit sur des plaques LB-kan (50 µg ml-1) à 37 ° CE. Des cellules coli BL21 (DE3) (Novagen) ont été transformées avec le vecteur d'expression, puis cultivées pour phase exponentielle à 37 °C dans du milieu Luria Bertani (LB) contenant 50 µg/ml de kanamycine. Ecm16 * a été cloné dans le vecteur pET28a (+) en utilisant la même procédure en utilisant les enzymes de digestion de restriction EcoR1 et HindII aux sites 5 'et 3' respectivement. L'expression d'ecm16 a été induite à l'aide de 0, 25 mM d'isopropyl-d-1-thiogalactopyranoside (Thermo Scientific) à une densité optique à OD600 de 0, 6 à 0, 8. Les cellules ont ensuite été cultivées pendant 16 h à 18 ° C, puis récoltées par centrifugation à 6000 × g pendant 15 min à 4 ° C. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon de lyse (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazole 10 mM et glycérol 5 % (v/v), fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM, DNase 10 µg/ml et MgCl2 10 mM) et lysé par sonication. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 30 000 × g pendant 60 min à 4 ° C et le matériel insoluble a été éliminé. La fraction soluble a été chargée sur une colonne Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare) qui a été équilibrée avec un tampon de liaison (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl), lavée avec 250 ml de tampon de lavage (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl , 30 mM d'imidazole et 5 % (v/v) de glycérol), et la protéine liée a été éluée avec un tampon d'élution (50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM NaCl, 250 mM imidazole). La solution de protéine éluée a été appliquée à une colonne HiTrap QHP HP de 5 ml (GE Healthcare) et la protéine liée a été éluée à l'aide d'un gradient linéaire de NaCl de 50 à 500 mM. Enfin, les échantillons d'Ecm16 ont été purifiés par chromatographie d'exclusion stérique dans HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 50 mM à l'aide d'un Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare). La pureté de la protéine a été dosée par SDS-PAGE. Les échantillons de protéines ont été concentrés à l'aide d'un filtre centrifuge Amicon 10-kDa MWCO. Toutes les étapes de purification ont été réalisées à 4°C. Les variants Ecm16-ΔID et Ecm16* ont été préparés de la même manière que la protéine Ecm16 de type sauvage.

Pour les études in vivo utilisant E. coli, ecm16 et ecm16-ΔID à codons optimisés provenant de vecteurs pET28a précédemment construits ont été amplifiés avec les sites SacI et EcoRI à l'aide de la polymérase Phusion (New England Biolabs). Les gènes ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,7 % et purifiés sur gel. Après purification, les gènes ont été digérés avec SacI et EcoRI (New England Biolabs) et clonés dans un vecteur pBAD-Myc-HisA digéré de manière similaire (Thermo Fisher). Après digestion, le vecteur a été traité avec de la phosphatase alcaline de crevette (New England Biolabs). Le vecteur digéré et les fragments digérés ont été séparés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,7 % et purifiés à nouveau sur gel. Les fragments ont été ligaturés dans le vecteur pBAD à l'aide de l'ADN ligase T4 (New England Biolabs), puis transformés en cellules DH-5α électrocompétentes et cultivées pendant la nuit. sur des plaques LB-amp (100 µg ml-1) à 37 °C, des cellules de coli BW25113 (Coli Genetic Stock Center) ont été transformées avec le vecteur d'expression puis cultivées en phase exponentielle à 37 °C dans du milieu LB contenant 50 µg/ml d'ampilcilline . La construction de cellules BW25113 avec ecm16 * a été réalisée de la même manière que BW25113-ecm16 et BW25113-ecm16-ΔID, à l'exception que les sites HindIII et EcoRI ont été utilisés pour la digestion de restriction.

Le gène UvrA de Thermotoga maritima a été codé dans le vecteur pET28a (+) et transformé dans des cellules pLysS d'E. coli Rosetta (DE3). L'expression des protéines a été induite à l'aide de 50 µM d'isopropyl-ß-d-galactoside (IPTG) et incubée pendant 5 h à 30 °C. Les cellules bactériennes ont été remises en suspension dans un tampon contenant 50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 2 mM de dithiothréitol (DTT), 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et 5 % (v/v) de glycérol et soniquées. Le lysat a été centrifugé à 18 000 tr/min pendant 45 min et le surnageant a été appliqué sur une colonne His-Trap brut de 5 ml (GE Healthcare). UvrA a été éluée avec un gradient d'imidazole de 200 ml d'une concentration de 0 à 500 mM. La protéine purifiée a été diluée avec un tampon contenant 50 mM de Tris pH 8,0, 2 mM de DTT et 5 % (v/v) de glycérol et appliquée sur une colonne HiTrap Q HP de 5 ml (GE Healthcare). UvrA a été éluée avec 50 ml de gradient linéaire de NaCl de 50 mM à 1 M. La protéine a ensuite été purifiée par chromatographie d'exclusion stérique à l'aide de Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) équilibré avec un tampon contenant 50 mM Tris pH 8,0, 200 mM NaCl, DTT 2 mM et glycérol 5 % (v/v). Le volume de l'échantillon de protéine collecté a été réduit à une concentration finale de 10 mg/ml et congelé instantanément dans de l'azote liquide.

Les cristaux d'Ecm16 ont été cultivés à 18 ° C par diffusion de vapeur en utilisant la méthode de la goutte suspendue en mélangeant 1 µl de solution de protéines (8 mg ml-1 Ecm16, 10 mM MgCl2, 1 mM ADP) avec 1 µl de tampon d'équilibrage (0,1 M MES pH 6,5, thiocyanate de sodium 0,2 M et 12 % PEG (p/v) 20 K). Les cristaux ont été transférés dans le même tampon contenant 20 % v/v d'éthylène glycol avant la congélation éclair.

Les expériences initiales de diffraction des rayons X ont été réalisées à la Stanford Synchrotron Radiation Lightsource. L'ensemble final de données de diffraction des rayons X a été collecté sur la ligne de lumière 17-ID-B de l'Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory et traité à l'aide d'autoPROC24. Le remplacement moléculaire a été effectué en utilisant PHASER25 et la structure UvrA2 (PDB : 2VF7)15 comme modèle de recherche. Le raffinement de la structure a été effectué à l'aide de PHENIX26 et REFMAC27. La construction du modèle a été réalisée à l'aide de COOT28 avec des sessions alternées de raffinement à l'aide de PHENIX26.

Le gène ecm16 optimisé en codons pour l'expression dans B. choshinensis a été synthétisé (GenScript) et inséré dans le vecteur pUC19 à l'aide des sites BamHI et XbaI. pNI, un vecteur navette entre B. choshinensis et E. coli, a été acheté chez Takara Bio. Le vecteur pNI se trouve sous le promoteur P2, qui est une partie de la séquence 5' en amont de la protéine de la paroi cellulaire, qui est fortement exprimée chez B. choshinensis. ecm16 a été inséré dans le vecteur pNI en suivant le protocole de ligation décrit ci-dessus. Les produits de ligature ont été transformés dans des cellules E. coli DH5α chimiquement compétentes et cultivés pendant la nuit sur des plaques LB-amp (50 µg ml-1) à 37 °C. Le clone ecm16_pNI a été vérifié en effectuant une digestion par des enzymes de restriction à l'aide de BamHI et XbaI. Les plasmides ecm16_pNI ou pNI ont été transformés dans B. choshinensis en utilisant la méthode New Tris-PEG (NTP) en suivant les directives du fabricant (Takara Bio)29. En bref, 100 ng de plasmide mélangés à la solution A (Takara Bio) ont été ajoutés au culot cellulaire compétent de B. choshinensis et incubés pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, la solution B contenant du PEG a été ajoutée, vortexée et centrifugée. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans du milieu MT, suivi d'une incubation à 37 ° C pendant 3 h. Les cellules ont ensuite été étalées sur des plaques de gélose MT contenant de la néomycine (50 µg ml-1) et cultivées pendant une nuit à 37 ° C. 4 à 5 colonies ont été inoculées dans 3 ml de milieu liquide 2SYNm et cultivées à 30 ° C pendant 48 h avec agitation orbitale à 120 tr / min. Les cellules ont été centrifugées et les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un tampon phosphate 1X (phosphate de sodium 100 mM à pH 7,0). L'expression de Ecm16 dans B. choshinensis a été confirmée par analyse SDS-PAGE.

Des solutions mères de 908 uM d'échinomycine (MilliporeSigma) et 864 uM de thiocoraline (Cayman Chemical) ont été préparées dans du méthanol. Des solutions mères de quinaldopeptine 805 µM (Cayman Chemical) et de sandramycine 819 µM (Cayman Chemical) ont été préparées dans du DMSO. Pour la courbe de croissance et les études biochimiques, tous les composés ont été dilués avec H2O. Pour les expériences de courbe de croissance d'E. coli, les cultures ont été cultivées pendant une nuit dans un milieu liquide LB additionné de 30 µg ml-1 d'ampicilline à 37 ° C et 200 tr/min. La culture saturée a été induite avec une solution d'arabinose à 0,2 % pendant 30 minutes et utilisée pour inoculer 2 ml d'échantillons en double à 0,02 DO600 dans des tubes en verre de 13 mm. Les lectures OD600 ont été prises toutes les 30 min pendant 6 h. Pour le profilage de la croissance de B. choshinensis dans un milieu 2SYNm, la DO600 a été mesurée à l'aide d'un lecteur de plaque multipuits (Synergy HT, BioTek). En règle générale, 3 µl de la culture d'une nuit avec une DO600 de 1,0 à 1,2 ont été utilisés pour inoculer un puits contenant 200 µl de milieu 2SYNm frais et la croissance a été surveillée toutes les 30 min pendant 10 h dans une plaque à 96 puits.

Le substrat d'ADN de 32 pb purifié par PAGE (Integrated DNA Technologies) a été dissous dans un tampon d'hybridation (HEPES 30 mM, pH 7,5, acétate de potassium 100 mM). Cet ADN contenait le site de liaison de l'échinomycine 5 'ACGT 3' (tableau S2). Le complexe échinomycine-ADN a été formé en incubant l'échinomycine et l'ADN à un rapport molaire de 1,1 : 1. Différentes concentrations d'Ecm16 purifié, Ecm16-ΔID, Ecm16* (0, 100, 200 et 300 nM) ont été incubées avec 50 nM d'ADN dans le présence ou absence d'échinomycine dans un tampon de liaison (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,1 mg ml-1 albumine de sérum bovin) pendant 15 min à température ambiante. Le mélange réactionnel a été séparé dans un gel de polyacrylamide natif à 6% à 4 ° C en utilisant du TBE 1 × (acétate de Tris 40 mM, EDTA 0, 5 mM) comme tampon de fonctionnement pendant 30 min à 40 mA. Les gels ont été colorés à l'aide d'une coloration d'acide nucléique d'or SYBR 1 × dans un tampon TBE 1 × et imagés à l'aide d'un transilluminateur ultraviolet (Azure c200).

Un oligonucléotide d'ADN de 32 pb marqué à la fluorescéine (Integrated DNA Technologies) a été dissous dans un tampon de liaison (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM) et aliquoté à une concentration finale de 50 nM dans le puits de réaction. L'Ecm16 ou l'Ecm16-ΔID ou l'Ecm16* purifié en présence ou en l'absence d'échinomycine a été dilué en série dans un tampon de liaison et ajouté à chaque puits de réaction jusqu'au volume final de 100 µl à une concentration allant de 4 à 512 nM. Pour détecter le changement de polarisation de la lumière de l'ADN marqué au FAM, des mesures de fluorescence ont été effectuées dans un format de 384 puits sur une plaque noire à faible volume (Corning) à l'aide d'un lecteur de plaque Synergy HT (BioTek) avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 490 nm et 520 nm, respectivement. Les valeurs de polarisation rapportées sont la moyenne de trois expériences indépendantes. Les données ont été analysées dans Graph Pad Prism 5 en utilisant l'équation de Hill. Les constantes de dissociation calculées (KD) sont répertoriées dans le tableau 3.

L'activité ATPase des protéines purifiées a été déterminée en utilisant le kit de dosage du phosphate EnzChek™ (Thermo Fisher). Dans ce test, le phosphate inorganique produit à partir de l'hydrolyse de l'ATP est utilisé par la purine nucléoside phosphorylase (PNP) pour convertir la 2-amino-6-mercapto-7-méthylpurine (MESG) en ribose 1-phosphate et 2-amino-6-mercapto-7 -méthylpurine. La formation du produit est suivie en mesurant l'absorbance à 360 nm. Avant le test ATPase, l'échinomycine a été incubée avec de l'ADN de 32 pb à un rapport molaire de 1, 1: 1 pendant 15 min à température ambiante. L'Ecm16 purifié (0,2 µM) a été incubé avec 1 µM d'ADN ou un complexe échinomycine-ADN à diverses concentrations d'ATP (0,125, 0,325, 0,75, 1,0, 1,5 et 2,0 µM) dans un tampon de réaction (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Le substrat MESG (200 µM) et l'enzyme PNP (500 µM) ont été ajoutés et l'absorbance UV à 360 nm a été mesurée toutes les 30 s à l'aide d'un lecteur de microplaques (Synergy HT, BioTek) à 22 °C. Pour convertir la densité optique à 360 nm en quantité d'ATP dégradé, une courbe d'étalonnage a été construite en traçant la DO360nm avec des standards de phosphate.

Les coordonnées Ecm16 et les facteurs de structure ont été déposés dans la Protein Data Bank avec le code d'accession 7SH1.

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Nous remercions le Dr Marcin Nowotny pour avoir fourni le plasmide d'expression pour Thermotoga maritima UvrA. Les données de diffraction des rayons X ont été recueillies à l'Advanced Photon Source et à la Stanford Synchrotron Radiation Lightsource. Advanced Photon Source, une installation utilisateur du Bureau des sciences du DOE exploitée pour le Bureau des sciences du DOE par le Laboratoire national d'Argonne sous le contrat n° DE-AC02-06CH11357. L'utilisation de la source de lumière à rayonnement synchrotron de Stanford, SLAC National Accelerator Laboratory, est soutenue par le Département américain de l'énergie, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences sous le contrat n° DE-AC02-76SF00515. Le programme de biologie moléculaire structurale SSRL est soutenu par le Bureau de la recherche biologique et environnementale du DOE et par les National Institutes of Health, National Institute of General Medical Sciences (y compris P41GM103393). Ce travail a été soutenu par le prix System STARs de l'Université du Texas (C.-YK), Projects of International Cooperation in Shaanxi Province of China 2023-GHYB-08 (XC), Open Project Program of the State Key Tumor Biology Laboratory CBSKL2022KF13 (XC ).

Chu-Young Kim

Adresse actuelle : Department of Biochemistry, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, États-Unis

Département de chimie et de biochimie, Université du Texas à El Paso, El Paso, TX, États-Unis

Priyanka Gade, Anwar Ullah et Chu-Young Kim

Département de microbiologie, École de biologie moléculaire et cellulaire, Université de l'Illinois Urbana-Champaign, Urbana, Illinois, États-Unis

Amanda Erlandson et Paola E. Mera

Key Laboratory of Synthetic and Natural Functional Molecule of the Ministry of Education, College of Chemistry and Materials Science, Northwest University, Xi'an, 710127, Chine

Xi Chen

Source lumineuse de rayonnement synchrotron de Stanford, Laboratoire national de l'accélérateur SLAC, Menlo Park, Californie, États-Unis

Irimpan I. Mathews

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PG, AU, XC, IIM et C.-YK ont réalisé des expériences de cristallographie aux rayons X. PG, AE, PEM et C.-YK ont réalisé des études biochimiques et cellulaires. PEM et C.-YK ont conçu et supervisé l'étude et analysé les données. PG et C.-YK ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Paola E. Mera ou Chu-Young Kim.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Gade, P., Erlandson, A., Ullah, A. et al. Analyses structurelles et fonctionnelles de la protéine conférant la résistance à l'échinomycine Ecm16 de Streptomyces lasalocidi. Sci Rep 13, 7980 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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Reçu : 14 septembre 2022

Accepté : 29 avril 2023

Publié: 17 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34437-9

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