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May 12, 2023

Cartographie des oligonucléotides par spectrométrie de masse pour permettre la caractérisation complète de la structure primaire d'un vaccin à ARNm contre le SRAS

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9038 (2023) Citer cet article

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La cartographie oligonucléotidique par chromatographie liquide avec détection UV couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-UV-MS/MS) a été récemment développée pour soutenir le développement de Comirnaty, le premier vaccin commercial à ARNm au monde qui immunise contre le virus SARS-CoV-2. Analogue à la cartographie peptidique des modalités protéiques thérapeutiques, la cartographie oligonucléotidique décrite ici fournit une caractérisation directe de la structure primaire de l'ARNm, par digestion enzymatique, déterminations de masse précises et fragmentation optimisée induite par collision. La préparation des échantillons pour la cartographie des oligonucléotides est une digestion rapide, en un seul pot et à une enzyme. Le condensé est analysé via LC-MS/MS avec un gradient étendu et l'analyse des données qui en résulte utilise un logiciel semi-automatisé. Dans une seule méthode, les lectures de cartographie d'oligonucléotides comprennent un chromatogramme UV hautement reproductible et complètement annoté avec une couverture de séquence maximale de 100 %, et une évaluation de la microhétérogénéité du coiffage de l'extrémité 5' et de la longueur de la queue poly(A) de l'extrémité 3'. La cartographie oligonucléotidique était essentielle pour garantir la qualité, la sécurité et l'efficacité des vaccins à ARNm en fournissant : la confirmation de l'identité de la construction et de la structure primaire et l'évaluation de la comparabilité des produits après les modifications du processus de fabrication. Plus largement, cette technique peut être utilisée pour interroger directement la structure primaire des molécules d'ARN en général.

Deux vaccins à ARN messager (ARNm), Comirnaty de Pfizer-BioNTech et Spikevax de Moderna, ont été approuvés par la FDA, l'EMA et d'autres organismes de réglementation du monde entier pour lutter contre la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)1,2. Le COVID-19 est causé par une infection par le coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)3. Les vaccins à ARNm peuvent être utilisés pour l'immunisation, car ils contiennent les instructions génétiques pour l'auto-traduction de la protéine immunogène cible4. L'ARNm des vaccins COVID-19 approuvés code pour la protéine S-2P5, qui diffère de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 par deux mutations stabilisatrices de la proline qui engendrent une conformation de préfusion6. La substance médicamenteuse (DS) de l'ARNm est fabriquée par transcription in vitro ( IVT) utilisant la polymérase du bactériophage T7 avec la N1-méthyl pseudouridine formant un ARN messager modifié par un nucléoside (modARN). modRNA DS est ensuite encapsulé avec des nanoparticules lipidiques (LNP) pour la livraison cellulaire et la protection contre les forces de dégradation. Les modRNA-LNP formulés comprennent le produit médicamenteux (DP) qui est administré pour la vaccination.

Les fabricants de médicaments ont la responsabilité absolue de caractériser et de comprendre la structure moléculaire, la séquence, l'hétérogénéité et les impuretés des médicaments et vaccins finaux qu'ils commercialisent. La structure primaire générale de l'ARNm DS, de l'extrémité 5 'à l'extrémité 3', est la suivante : 5 'Cap, 5' région non traduite (UTR), région codant pour l'antigène, 3' UTR et 3' queue de polyadénosine (poly (A) -tail)7 dans un format simple brin. Pour être compétent en traduction, l'ARNm doit être coiffé à son extrémité 5'8 et avoir une queue poly(A) avec un nombre suffisant de nucléotides d'adénosine consécutifs9. La coiffe 5′ est souvent un triphosphate de guanosine N7-méthylé terminal 5′ relié au carbone 5′ du ribose du nucléotide adénosine ou guanosine suivant, qui peut également être méthoxylé sur son carbone 2′10. Ces attributs de coiffe 5 'et de queue poly (A) confèrent également une stabilité en protégeant l'ARNm des processus de dégradation cellulaire11,12. L'intégrité de la structure primaire de l'ARNm pleine longueur, y compris la coiffe 5 'et les terminaisons poly(A)-tail, représente des attributs de qualité critiques pour le vaccin DS qui sont étroitement surveillés pour garantir la qualité souhaitée du produit.

De multiples techniques chromatographiques et électrophorétiques de « cartographie oligonucléotidique » ont été développées au cours des dernières décennies13,14,15. Plus récemment, des méthodes de caractérisation de l'ARNm basées sur la spectrométrie de masse (MS) utilisant la chromatographie liquide haute performance en phase inverse de paires d'ions couplée à la spectrométrie de masse (IP RP-HPLC-MS) ont été développées pour une caractérisation approfondie de l'ARNm 5 'Cap16 des vaccins. et 3′-Poly(A)-queue17. Cependant, ceux-ci nécessitent une purification et des méthodes analytiques dédiées pour la caractérisation de chaque extrémité. Des méthodes analytiques supplémentaires utilisant des digestions enzymatiques et IP RP-HPLC avec et sans MS en tandem (MS/MS) pour le séquençage d'oligonucléotides de gros ARN ont récemment été développées18,19,20,21,22. Diverses enzymes en solution22, ou RNase T1 immobilisée sur des particules magnétiques, ont été évaluées pour une couverture de séquence améliorée. Nakayama et al. a développé une méthode de profilage d'ARNm basée sur LC-MS en utilisant des normes marquées par des isotopes stables. Malgré les travaux pionniers sur la caractérisation de la structure primaire de l'ARN discutés précédemment18,19,20,21,22, il est avantageux pour le domaine de disposer d'une méthode analytique à la fois complète et simple à utiliser. Une carte oligonucléotidique idéale adaptée à une mise en œuvre simple est capable de caractériser directement et efficacement toute la longueur de l'ARN, y compris l'hétérogénéité terminale 5 'Cap et 3', dans un seul pot, une digestion enzymatique, ne nécessitant aucun isotope stable marqué contrôles. Il résout les isomères de séquence et produit un chromatogramme UV entièrement annoté avec une carte de couverture de séquence maximale.

Ici, nous décrivons une méthode de cartographie oligonucléotidique pour la caractérisation directe et complète de la structure primaire de l'ARNm pleine longueur, en utilisant Comirnaty comme étude de cas. Notre méthode de cartographie d'oligonucléotides utilise une chromatographie liquide ultra-haute performance en phase inversée à paires d'ions de pointe avec détection UV (IP-RP-UHPLC-UV) couplée à une spectrométrie de masse en tandem à ionisation électrospray ultra-haute résolution (ESI MS / MS) pour séparer et identifier les fragments d'oligonucléotides générés par la digestion de la ribonucléase T1 (RNase T1). Des outils d'analyse de données personnalisés permettent des lectures complètes semi-automatisées de la structure primaire : (1) chromatogramme UV entièrement annoté avec des centaines de produits de digestion qui représentent l'empreinte spécifique de la structure primaire de l'ARNm, (2) carte de couverture montrant une couverture de séquence unique et maximale, ( 3) Évaluation de la microhétérogénéité terminale 5′ Cap et 3′.

Le vaccin Pfizer-BioNTech COVID-19 a été lancé sur 186 marchés dans le monde en juillet 202223. Pour faciliter ce déploiement, une série d'études d'élucidation structurelle et de comparabilité utilisant la cartographie des oligonucléotides ont été réalisées et déposées auprès des autorités sanitaires mondiales. Cela a démontré que de nouveaux sites de fabrication de DS et des échelles de production accrues, introduits pour accroître la capacité et l'approvisionnement mondial du vaccin, produisaient de l'ARNm avec une qualité de produit comparable aux lots contemporains. Ici, notre méthode de cartographie oligonucléotidique a facilité l'évaluation complète de la structure primaire de Comirnaty DS en une seule méthode avec une couverture de séquence maximale de 100 %. Des paramètres de fragmentation MS/MS optimisés et un logiciel spécialisé en conjonction avec un logiciel commercial étaient essentiels pour distinguer les isomères de séquence oligonucléotidique pour une couverture de séquence maximale élevée. Notre méthode complète et semi-automatisée de cartographie d'oligonucléotides a été développée pour fournir une caractérisation accrue de l'ARNm pleine longueur de la séquence, des formes terminales et des modifications potentielles. Il s'agit d'un élément essentiel de la compréhension de la structure primaire de l'ARNm, de l'évaluation de la comparabilité, et il peut être utilisé comme test d'identité DS orthogonal pour différencier les séquences d'ARNm hautement similaires dérivées des variants du SRAS-CoV-2.

La cartographie oligonucléotidique a été développée avec un lot représentatif de Comirnaty BNT162b2 Original DS (c'est-à-dire le vaccin original Pfizer-BioNTech COVID-19 qui code pour la glycoprotéine de pointe (S) du virus SARS-CoV-2, l'isolat Wuhan-Hu-1 : GenBank: QHD43416.1) et il a été appliqué aux constructions Comirnaty BNT162b2 ultérieures (BNT162b2s04 [Delta] et BNT162b2s05 [Omicron]) et à d'autres molécules d'ARNm du portefeuille. Cinquante microgrammes d'ARNm DS ont été digérés avec 2500 U de RNase T1 dans un tampon Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) 50 mM pH 7, 5 avec 20 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 90 min à 37 ° C. La solution de fragment enzymatique résultante a été dopée avec une émulsion de triéthylamine (TEA) 10 × et de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) pour donner une concentration v/v finale de 0,1 % de TEA 1 % HFIP. Une charge de 4 µg a été injectée et les fragments ont été séparés par chromatographie liquide ultra haute performance en phase inversée (IP RP-UHPLC) avec détection UV à 260 nm à l'aide d'un système 1290 Infinity II Bio LC (Agilent) associé à un oligonucléotide ACQUITY Premier. Colonne C18 : 130 Å, 1,7 µm, 2,1 × 150 mm (Waters). Chaque phase mobile contenait 0,1 % de TEA et 1 % de HFIP. Le TEA fonctionne comme agent d'appariement d'ions et le HFIP fournit un tampon compatible MS en tant qu'acide faible volatil. Le gradient a progressé de 1 à 17 % de phase mobile B (50 % de méthanol) en 195 min, puis de 17 à 35 % de B en 60 min, suivi de segments de lavage et d'équilibrage. Le débit était de 0,2 ml/min avec une séparation post-colonne : 50 µl/min vers le détecteur à barrette de diodes UV et 150 µl/min vers un spectromètre de masse Orbitrap Eclipse Tribrid (Thermo Fisher Scientific). L'acquisition MS par ionisation électrospray (ESI) en ligne a été effectuée en mode ion négatif avec une tension de pulvérisation de 2700 V. Les balayages MS allaient de 400 à 2000 m/z à 120 000 pouvoir de résolution (RP) à 400 m/z. La spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) a été réalisée à 30 000 RP par une dissociation collisionnelle à énergie plus élevée (HCD) de 17, 21, 25 étapes de candidats précurseurs à charges multiples sélectionnés par l'algorithme d'acquisition dépendant des données (DDA).

Le logiciel BioPharma Finder version 5.0 (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour identifier les oligonucléotides sur la base des correspondances MS et MS/MS avec les produits de digestion théoriques de la RNase T1. Une correspondance MS nécessitait que la masse neutre d'oligonucléotide observée soit à moins de 5 ppm de la masse théorique. Une correspondance MS/MS exigeait que tous les fragments majeurs aient été identifiés et que la séquence complète puisse être déduite des ions fragments contenant les extrémités 5' ou 3' (et non des fragments internes). Pour s'assurer que le logiciel automatisé employait une correspondance MS/MS stricte, le logiciel a également recherché l'ensemble de données LC-MS/MS par rapport aux digests théoriques de RNase T1 de constructions leurres ayant des arrangements aléatoires de la même composition de nucléotides que la molécule d'ARNm. Pour augmenter la liste des identifications de logiciels automatisés, des scripts Excel Visual Basic pour Applications (VBA) ont été utilisés pour examiner les caractéristiques LC-UV non identifiées et les spectres de masse sous-jacents un par un. Le logiciel Protein Metrics Byos a été utilisé pour caractériser les terminaisons 5 'ou 3', y compris le 73-mer R1062 et ses espèces de queue poly (A) apparentées. Les identifications 5′ ou 3′ ont été réalisées à l'aide de spectres de masse déconvolués à charge nulle, sans MS/MS.

La méthode détaillée étape par étape est fournie sous la forme d'un document de données supplémentaires qui décrit le traitement enzymatique de l'échantillon, la séparation et la détection des oligonucléotides par UHPLC-UV et l'identification des oligonucléotides par spectrométrie de masse à haute résolution. Il décrit également comment utiliser plusieurs outils Excel VBA, le logiciel BioPharma Finder et Protein Metrics Byos pour obtenir une caractérisation accrue de la digestion de l'ARNm.

La structure primaire de l'ARNm destinée à un vaccin ou à un médicament thérapeutique est considérée comme un attribut de qualité critique par les organismes de réglementation et son intégrité doit être confirmée empiriquement pour garantir la qualité, la sécurité et l'efficacité. La technique idéale de caractérisation de la structure primaire fournit une élucidation sans ambiguïté de la séquence d'ARNm pleine longueur, des extrémités 5 'et 3' et de toute modification spécifique au site par mesure directe de la molécule d'ARNm.

Une méthode de cartographie d'oligonucléotides à enzyme unique a été développée pour caractériser directement la structure primaire de l'ARNm original de Comirnaty BNT162b2 en combinant IP RP-HPLC-UV-MS et MS/MS pour séparer et identifier tous les oligonucléotides produits par digestion à la RNase T1. Il a permis la détection de 388 oligonucléotides. Soixante-quatorze de ces oligonucléotides apparaissent plus d'une fois dans la construction : ce sont des répétitions de motifs de séquence avec différentes positions de départ (loci). Si de tels oligonucléotides observés proviennent de chaque locus dans la construction lors de la digestion par la RNase T1, alors tous les 4283 nucléotides théoriques dans BNT162b2 ont été échantillonnés par le procédé. Ainsi, la couverture de séquence maximale possible obtenue par cette méthode était de 100 %. Les 314 autres oligonucléotides proviennent chacun d'un seul locus dans la construction. Il n'y a pas d'ambiguïté sur leur origine : ils représentent 2380 nucléotides, donnant une couverture de séquence unique de 55,6 %. A l'exception des oligonucléotides à queue poly(A) longue, tous les oligonucléotides ont été identifiés par appariement du spectre de fragmentation MS/MS.

La digestion de l'ARN par la RNase T1 clive le squelette phosphodiester du côté 3 'de chaque nucléotide de guanosine et laisse un phosphate sur le carbone 3' du ribose de guanosine à l'extrémité 3'. Ainsi, il n'y a pas de phosphate sur le carbone 5' du nucléotide ribose de l'extrémité 5' d'un produit de digestion par la RNase T1. Un produit de digestion par clivage manqué est un oligonucléotide avec un ou plusieurs nucléotides de guanosine internes (non terminaux en 3 '). Une digestion théorique par la RNase T1 de BNT162b2 crée 1062 oligonucléotides qui se regroupent en 302 oligonucléotides uniques en raison des répétitions de motifs de séquence dans la construction. Sur les 388 oligonucléotides identifiés dans l'étude, 302 sont des produits de digestion théoriques de la RNase T1. Les 86 autres oligonucléotides comprennent 23 poly(A)-queue supplémentaires, 49 clivages manqués et 14 oligonucléotides de clivage non spécifiques (tableau de données supplémentaire 1).

La première lecture de la cartographie des oligonucléotides est un chromatogramme UV entièrement annoté des produits de digestion de la RNase T1 (Fig. 1A), qui est généré en faisant correspondre les temps de rétention de chaque oligonucléotide identifié par MS à son pic UV correspondant. En général, la méthode sépare les espèces par le nombre de résidus nucléotidiques, les oligonucléotides plus courts éluant avant les oligonucléotides plus longs. Les interactions dominantes phase inverse stationnaire-analyte sont avec les paires d'ions du squelette triéthylammonium-phosphodiester. Pour chaque sous-ensemble de longueurs d'oligonucléotides, l'ordre d'élution est influencé par la composition des nucléobases et la séquence. En particulier, le nucléotide 5'-end influence cet ordre. Pour les oligonucléotides de même longueur, l'ordre d'élution a tendance à être C d'abord, puis V, puis A (V représente N1-méthyl pseudouridine; Données supplémentaires Fig. 1).

Carte des oligonucléotides RNase T1 de BNT162b2 Original DS. (A) IP RP-UHPLC-UV-MS/MS RNase T1 carte oligonucléotidique de BNT162b2 Original DS, 14–254 min. "R" représente les produits de digestion de l'oligonucléotide RNase T1 indexés de l'extrémité 5' à 3'. "*" désigne un oligonucléotide à répétition de séquence, où l'attribution de pic unique représente tous les oligonucléotides identiques dans la séquence. Chaque couleur distingue le nombre de nucléotides par produit de digestion : bleu : 4, 10 et 16 ; vert : 5 et 11 ; or : 6 et 12 ; rouge : 7 et 13, violet : 8 et 14, noir : 9 et 15, magenta : > 16. Pour la clarté graphique, tous les oligonucléotides observés ne sont pas annotés sur le chromatogramme ; une liste complète se trouve dans le tableau de données supplémentaire 1. (B) IP RP-UHPLC/UV/MS/MS RNase T1 carte oligonucléotidique de BNT162b2 Original DS, 0–20 min. "R" représente les produits de digestion de l'oligonucléotide RNase T1 indexés de l'extrémité 5' à 3'. "*" désigne un oligonucléotide à répétition de séquence, où l'attribution de pic unique représente tous les oligonucléotides identiques dans la séquence. Chaque couleur distingue le nombre de nucléotides par produit de digestion : rouge : 1 ; violet : 2 ; noir : 3 ; bleu : 4 ; vert : 5. Pour plus de clarté graphique, tous les oligonucléotides observés ne sont pas annotés sur le chromatogramme ; une liste complète se trouve dans le tableau de données supplémentaires 1. (C) La couverture de séquence unique de 55,6 % est illustrée en bleu et vert, sur la base de 314 oligonucléotides à séquence unique observés. Les nucléotides bleus comprennent des oligonucléotides de RNase T1 à séquence unique ; les nucléotides verts comprennent des oligonucléotides de clivage manqué et de fragment à séquence unique. Les nucléotides verts et blancs comprennent également des oligonucléotides de RNase T1 à séquence répétée, sur la base de 74 oligonucléotides à séquence répétée observés. "V" est N1-méthyl pseudouridine.

En raison des répétitions de motifs de séquence, certaines caractéristiques de la carte oligo proviennent de plus d'un locus de digestion. Par exemple, le produit de digestion "AAAG" s'éluant à 15,8 min est un oligonucléotide à répétition de séquence qui peut provenir d'un ou jusqu'à tous les 4 de ses loci dans la séquence. Le premier locus AAAG dans la construction BNT162b2 se trouve aux résidus nucléotidiques 514-517 ; il suit le 118ème G en comptant à partir de l'extrémité 5' et est ainsi désigné oligonucléotide « R119 ». Cet oligonucléotide 4-mer possède quatre chromophores UV 260 nm et sa surface de pic LC/UV est de 2,88 × 105 (tableau de données supplémentaire 1). Aucun autre oligonucléotide ne co-élue avec cette espèce. Le 15-mer R606 avec la séquence ACCCCVCCVAVCAAG s'élue à 205 min sans espèce co-éluante et avec une surface de pic de 2,55 × 105. Par similarité dans les surfaces de pic et en stoechiométrie des chromophores, il est raisonnable de conclure que la caractéristique AAAG de 16 min est composé des quatre produits de digestion d'oligonucléotides RNase T1 AAAG (R119, R731, R914 et R1046). Les aires de pic LC/UV observées de tous les pics ont été comparées à leurs aires de pic prédites (théoriques) compte tenu de leur attribution d'oligonucléotide, montrant que les pics LC-UV composés d'oligonucléotides à répétition de séquence ont des contributions de tous leurs locus (Données supplémentaires Fig. 2) . Ainsi, la cartographie oligonucléotidique de BNT162b2 a atteint une couverture de séquence maximale possible de 100 %.

Pour simplifier le chromatogramme de la carte oligonucléotidique de la figure 1, les séquences répétées ont été annotées avec la première instance de locus avec un suffixe astérisque ; ainsi la fonction 16 min est "R119*". La plupart des pics "*" sont de petits oligonucléotides : 1-mers (G), 2-mers (AG, CG, VG), 3-mers (AAG, etc.) ; le plus grand est un 8-mer, VACAVCVG, présent sur deux sites (R566 et R947). Ces séquences répétées constituent une partie importante de la construction BNT162b2. Le chromatogramme UV précoce (Fig. 1A et B) montre que les pics représentant des séquences répétées ont des zones de pic significatives, proportionnelles au nombre de loci pour chaque espèce (tableau de données supplémentaire 1).

Alors que les espèces de clivage manqué sont détectées à de faibles niveaux, ces séquences répétées abondantes indiquent que la digestion de la RNase T1 est en grande partie terminée à 90 min. Semblable au traitement conventionnel des peptides non uniques lors de la réalisation d'une cartographie peptidique par LC-MS/MS24, chaque locus d'un oligonucléotide non unique est pris en compte dans la détermination de la couverture de séquence maximale. Cela est également justifié compte tenu de la corrélation entre les zones de pic UV observées et prévues (Données supplémentaires, Fig. 2).

La deuxième lecture de la cartographie des oligonucléotides est la carte de couverture de séquence unique de chaque nucléotide détecté (Fig. 1C). En considérant le sous-ensemble d'oligonucléotides qui n'ont qu'un seul locus, la couverture de séquence unique était de 55,5 %. Tous les oligonucléotides théoriques à séquence unique digérés par la RNase T1 ont été observés.

Les changements de processus de fabrication cliniques et commerciaux (par exemple, le site, l'échelle) sont courants pendant la production de vaccins à ARNm, et les techniques analytiques doivent démontrer la comparabilité des produits pour les lots avant et après changement25. La cartographie oligonucléotidique fournit une évaluation directe et détaillée de la comparabilité de la structure primaire de l'ARNm sur plusieurs lots d'ARNm DS. Ceci est analogue à l'application de la cartographie peptidique par LC-UV-MS/MS pour l'évaluation de la comparabilité des lots de protéines thérapeutiques26. La structure primaire de l'ARNm de trois lots commerciaux de BNT162b2 a été jugée comparable (Fig. 2A), comme le démontrent la superposition des chromatogrammes pleine longueur et la superposition de segments zoomés des chromatogrammes (Données supplémentaires Fig. 3).

Comparabilité des lots et identité de construction analysée par cartographie oligonucléotidique. (A) Trois lots de DS originaux BNT162b2 fabriqués selon les BPF ont été évalués par cartographie oligonucléotidique. Les chromatogrammes UV résultants sont visuellement comparables, démontrant la cohérence du processus. Données supplémentaires La Fig. 3 fournit un agrandissement à six segments de ces données. Le lot 3 a été fabriqué à petite échelle ; Les lots 1 et 2 ont été fabriqués par le même procédé GMP. (B) Cartes oligonucléotidiques partielles de l'ARNm BNT162b2 Original, BNT162b2 Delta et BNT162b2 Omicron DS. Les séquences d'oligonucléotides RNase T1-digest indiquées en noir sont partagées par les 3 constructions variantes ; les séquences bleues sont partagées par les constructions BNT162b2 Original et BNT162b2 Delta ; le vert est partagé par les constructions BNT162b2 Original et BNT162b2 Omicron ; et les oligonucléotides orange et rouge sont uniques aux constructions BNT162b2 Delta et BNT162b2 Omicron, respectivement. (C) Cartes d'oligonucléotides partielles de deux lots de BNT162b2 Original superposés (volet supérieur) et d'un lot BNT162b2 Original superposé avec BNT162b2 Delta (volet inférieur). Les différences entre les chromatogrammes de construction BNT162b2 Original et BNT162b2 Delta sont annotées avec les oligonucléotides représentant la différence. Les oligonucléotides bleus sont partagés par les constructions BNT162b2 Original et BNT162b2 Delta ; l'oligonucléotide orange est unique à la construction BNT162b2 Delta. Les nombres entre parenthèses comptent le nombre de répétitions de séquence dans chaque séquence de construction : le rouge signifie le nombre d'occurrences dans la construction BNT162b2 Delta et le noir signifie le nombre d'occurrences dans la construction BNT162b2 Original.

Dans une analyse comparative similaire, la cartographie des oligonucléotides peut identifier une variance unique et subtile dans la structure primaire de l'ARNm. Les séquences de construction de vaccins variants SARS-CoV-2 Delta et Omicron, BNT162b2 Delta et BNT162b2 Omicron, sont similaires à 99,6% et 98,6% à BNT162b2 Original, comme indiqué dans les données supplémentaires Fig. 4. Les structures primaires d'ARNm des trois constructions présentaient un pic distinct différences de profil par cartographie oligonucléotidique (Fig. 2B), en raison d'oligonucléotides présents ou absents d'au moins l'un des trois. Sur les deux oligonucléotides originaux, un delta et 15 oligonucléotides Omicron qui sont uniques à leur construction, 16 ont été clairement différenciés par analyse UV et par chromatogramme d'ions extraits de la manière attendue (absents dans deux cartes de construction, présents dans un; Données supplémentaires Fig. 5). Dix-sept des 18 avaient une SEP/SEP distinctive. Seul le VCAG 4-mère Omicron unique co-élué avec des isomères de séquence qui empêchaient une identification MS/MS fiable.

La cartographie oligonucléotidique révèle également des différences subtiles dans la structure primaire à travers ces constructions variantes. Trois différences notables sont observées entre les oligonucléotides BNT162b2 Original BNT162b2 Delta dans la fenêtre chromatographique de 16 à 30 min (Fig. 2C). La première différence est un épaulement avant surélevé du pic UV Delta de 19 min. Cela s'explique par l'oligonucléotide CCVVG, identifié dans la carte BNT162b2 Delta mais pas dans la carte BNT162b2 Original. Il s'agit d'un produit de digestion RNase T1 attendu uniquement à partir de la séquence BNT162b2 Delta, et il représente un point de différence entre les séquences BNT162b2 Original et BNT162b2 Delta. Le pic UV à 21,8 min, identifié comme VVCCG, est moins abondant dans le chromatogramme BNT162b2 Delta que dans le chromatogramme BNT162b2 Original. Cela se produit parce qu'il s'agit d'un oligonucléotide à répétition de séquence avec deux loci dans la séquence BNT162b2 Original et un locus dans la séquence BNT162b2 Delta. A l'inverse, le pic UV à 27,0 min, identifié comme ACCAG, est plus abondant dans Delta par rapport à BNT162b2 Original car cet oligonucléotide provient de cinq loci dans la première séquence et de quatre loci dans la seconde.

Il est important de noter qu'aucune autre différence n'est apparente dans cette fenêtre chromatographique de 16 à 30 minutes (Fig. 2C), conformément à la tabulation théorique des oligonucléotides de digestion de RNase T1 attendus. Le chevauchement exact entre les chromatogrammes de ces variants montre qu'ils ont le même nombre stoechiométrique d'un seul oligonucléotide ou ensemble d'oligonucléotides. De plus, l'analyse comparative de BNT162b2 Original vs Delta par cartographie d'oligonucléotides fournit un contrepoint visuel important de comparaison de lot à lot, dans lequel la revendication de comparabilité visuelle par superposition est appropriée.

Un coiffage approprié de l'extrémité 5 'et une longueur appropriée de l'extrémité poly (A) 3' sont des attributs de qualité critiques pour un vaccin ou une thérapeutique à ARNm. La carte oligonucléotidique développée ici permet la caractérisation directe de la coiffe 5 'et de la queue poly (A) 3 'en une seule technique, sans avoir besoin d'isoler et de purifier l'une ou l'autre extrémité (Fig. 3). Les chromatogrammes ioniques extraits de l'extrémité 5 '(Fig. 3A) et les spectres de masse déconvolués qui l'accompagnent démontrent une détection sans ambiguïté d'espèces non plafonnées à l'état de trace (5'ppp-AG comme indiqué sur les Fig. 3A et B) par rapport à la forme correctement coiffée ( 5 'cap-AG comme indiqué sur les Fig. 3A et C) dans BNT162b2 Original, Delta et Omicron, en utilisant une masse précise à haute résolution. La majorité de l'extrémité 5 'est correctement coiffée dans chaque construction (cela a été confirmé par une analyse orthogonale basée sur LC-UV - données non présentées).

La cartographie oligonucléotidique de l'ARNm permet la caractérisation simultanée des extrémités 5 'et 3' sans purification par affinité. (A) Chromatogrammes ioniques extraits ([M-1H]1–, [M-2H]2–) des versions non coiffées (5′ppp-AG) et coiffées (5′ cap-AG) de l'oligonucléotide terminal 5′ pour BNT162b2 la variante construit Original, Delta et Omicron. (B, C) Spectres de masse déconvolutés à charge nulle des versions non coiffées (5′ppp-AG) et coiffées (5′cap-AG), respectivement, de l'oligonucléotide terminal 5′ pour les constructions variantes BNT162b2 Original, Delta et Omicron . Les spectres sont déconvolués à partir de la somme des balayages dans les régions mises en évidence dans le panneau A, à l'aide de Byos v4.4 (Protein Metrics). Les masses observées (monoisotopiques) correspondent aux masses théoriques à moins de 3 ppm, ce qui est cohérent avec l'exactitude et la précision des spectromètres de masse Orbitrap. (D) Chromatogrammes UV (260 nm) de la région de queue poly(A) pour les variantes BNT162b2 Original, Delta et Omicron : les régions d'oligonucléotides poly(A) A30 et L70 constituées des formules génériques C[A]nG, et ACV[A]n, sont étiquetés en conséquence. Les pics poly(A) A30 séparés par chromatographie sont marqués en fonction du nombre d'adénosines détectées dans chaque oligonucléotide. L'astérisque (*) indique une distribution d'oligonucléotide poly(A) A30 séparée résultant d'un clivage manqué de l'oligonucléotide poly(A) A30, consistant en la formule générique CCACACCCVGGAGCVAGC[A]nG. La boîte bleue met en évidence la distribution chromatographique des oligonucléotides L70 poly (A) (non séparés) qui sont décrits plus en détail dans les panneaux (E et F). (E) Spectres de masse déconvolués et à charge nulle de la distribution des oligonucléotides poly(A) L70 à partir de la somme des balayages dans la région en boîte bleue mise en évidence dans le panneau (D). Les pics spectraux de masse sont marqués en fonction du nombre d'adénosines détectées dans chaque oligonucléotide poly(A) L70. Le double astérisque (**) indique des distributions distinctes d'oligonucléotides L70 poly(A) résultant de la dégradation artéfactuelle des oligonucléotides L70 poly(A) pendant la préparation de l'échantillon. Les masses observées (monoisotopiques) correspondent aux masses théoriques à moins de 5 ppm, ce qui est cohérent avec l'exactitude et la précision des spectromètres de masse Orbitrap. Des erreurs de masse d'environ 1 et 2 Da dues à la désisotopisation se sont produites sur certaines espèces dans les distributions L70 poly(A) en raison de l'abondance relative à l'état de traces de ces espèces ou de l'interférence du signal d'autres espèces ; plus spécifiquement, un rapport signal/bruit insuffisant ou des interférences entraînent des distributions isotopiques non statistiques conduisant à des erreurs dans la détermination de la masse monoisotopique. (F) Chromatogrammes déconvolués extraits (XDC) de BNT162b2 Distribution originale d'oligonucléotides poly(A) L70 mise en évidence dans le panneau (E). L'ombrage coloré sur chaque oligonucléotide dans le panneau (E) correspond à son XDC.

La queue poly(A) codée par matrice de plasmide d'ADN de BNT162b2 Original, A30L70, consiste en une étendue de 30 résidus d'adénosine (segment A30), suivis d'une séquence de liaison de 10 nucléotides et de 70 résidus d'adénosine contigus supplémentaires (segment L70). En raison du glissement transcriptionnel de la polymérase IVT T727, plus d'une espèce de queue poly (A) est observée. La distribution A30 poly (A) est résolue par chromatographie à une résolution de nucléotide unique par la carte oligonucléotidique (Fig. 3D) et confirmée par profilage spectrométrique de masse (données non présentées). Cela confirme que la majorité des longueurs de segment A30 poly(A) dans BNT162b2 Original, Delta et Omicron se situent dans une plage de 29 à 33 résidus d'adénosine.

La distribution du segment poly(A) L70 s'élue sous la forme d'un seul large pic chromatographique. La carte oligonucléotidique est spécifiquement réglée pour une détection MS appropriée des produits de digestion RNase T1 plus grands dans ce segment du chromatogramme afin de caractériser la distribution de l'espèce L70 poly (A) (Fig. 3E). Les masses monoisotopiques observées des espèces L70 poly(A) ont été attribuées sur la base d'un accord de masse précis avec les masses théoriques attendues. La cartographie oligonucléotidique a confirmé que la majorité des longueurs de segment L70 poly(A) variaient de 71 à 88 dans BNT162b2 Original. Les chromatogrammes à charge nulle extraits de la distribution poly(A) originale de BNT162b2 L70 démontrent que l'augmentation du temps d'élution est corrélée à l'augmentation de la longueur de poly(A) (Fig. 3F). Ainsi, la longueur L70 poly(A) est un véritable reflet de la construction d'ARNm et non de la fragmentation artéfactuelle induite par l'ionisation par électrospray dans le spectromètre de masse. De plus, la carte oligonucléotidique a la sensibilité et la spécificité nécessaires pour détecter des changements subtils dans la distribution L70 poly(A) en raison du glissement transcriptionnel28 : les distributions L70 poly(A) de Delta et Omicron sont légèrement plus courtes que BNT162b2 Original (Fig. 3E).

La cartographie oligonucléotidique nécessite généralement des échelles ioniques de fragments MS/MS complètes pour une identification correcte sur un large éventail de longueurs de séquences (2-mers à > 20-mers). Sur les 302 séquences oligonucléotidiques uniques générées par une digestion RNase T1 in silico de BNT162b2 Original, 220 sont des isomères de séquence. Ceux-ci partagent la même composition, et donc la même masse, avec au moins un autre oligonucléotide, et beaucoup ne diffèrent que par un seul échange de nucléotide entre deux positions. Les isomères de séquence nécessitent des spectres MS/MS de haute qualité pour l'identification.

Historiquement, la fragmentation MS/MS d'oligoribonucléotide a été réalisée en utilisant la dissociation induite par collision (CID)29,30. Dans ce travail, nous avons utilisé une version mise à jour de la technique, la dissociation collisionnelle à énergie plus élevée (HCD), pour la cartographie des oligonucléotides. Des études expérimentales ont été réalisées pour examiner les effets de l'énergie HCD, de la longueur de l'oligonucléotide et de l'état de charge sur les types d'ions de fragment d'oligonucléotide et l'étendue de la fragmentation contiguë le long du squelette de l'ARN pour une couverture optimale de la séquence. En général, les schémas de fragmentation étaient complexes, comprenant souvent les quatre principaux types d'ions de fragments terminaux 5 '(a, b, c, d) et 3 '(w, x, y, z)31. Certains spectres HCD contenaient des ions fragments manquant d'une base d'identification unique (-B) et des fragments internes nés de plus d'une rupture de liaison phosphodiester. Nous observons que les fragments internes sont d'une utilité limitée pour déduire la séquence de l'oligonucléotide putatif, et ils diminuent la qualité des spectres en dégradant les fragments terminaux informatifs et en ajoutant des masses interférentes. Pour évaluer l'effet de l'énergie HCD sur les spectres sur l'ensemble de la carte d'oligonucléotides, la couverture de la séquence de construction d'ARNm a été surveillée. Les énergies HCD fixes 17, 21 et 25 étaient optimales (Fig. 4A) parmi une série d'acquisitions HCD MS/MS fixes à énergie unique. La couverture de séquence de construction d'ARNm la plus élevée a été obtenue en les combinant dans une méthode HCD 17, 21, 25 étagée.

L'énergie et la densité de charge optimales du HCD entraînent une fragmentation appropriée. (A) Relative BNT162b2 Couverture de séquence maximale originale déterminée par cartographie oligonucléotidique en fonction de l'énergie HCD. La couverture de séquence maximale résultant de chaque condition est normalisée à la condition finale recommandée (HCD étagé 17, 21, 25). La couverture de séquence maximale a été limitée uniquement aux oligonucléotides identifiés par BioPharma Finder en utilisant une restriction de paramètre de score de confiance de 100 %. (B) Spectres MS/MS et couverture en ions fragmentés de 3 oligonucléotides, présentés en fonction de l'énergie HCD et de la longueur de l'oligonucléotide. Les spectres MS/MS sont générés en utilisant les énergies HCD : 13, 21, 33 et 45, telles qu'appliquées aux oligonucléotides 7mer, 14mer et 21mer. Les ions fragmentaires identifiés comme 5′ (a,b,c,d), 3′ (w,x,y,z) et les fragments internes sont annotés par un code couleur tel que défini dans la clé. L'identification et l'annotation des ions fragments ont été réalisées à l'aide d'un outil Visual Basic Excel développé en interne. (C) Spectres MS/MS et couverture d'ions fragment de 3 oligonucléotides, présentés en fonction de la charge et de la longueur de l'oligonucléotide. Les spectres MS/MS sont générés à l'aide d'une méthode HCD à énergie unique (17, 21, 25) sur les états de charge faible, moyenne et élevée des mêmes oligonucléotides 7mer, 14mer et 21mer présentés dans le panneau B. Fragment ions identifiés comme 5 ' (a,b,c,d), 3′ (w,x,y,z) et les fragments internes sont annotés par un code couleur tel que défini dans la clé. L'identification et l'annotation des ions fragments ont été réalisées à l'aide d'un outil Visual Basic Excel développé en interne.

Ces résultats sont spécifiquement compris en examinant la couverture des ions fragments produite dans les spectres MS/MS en fonction de l'énergie HCD et de la longueur de l'oligonucléotide (Fig. 4B). Les densités de charge ionique des fragments d'oligonucléotides ont été maintenues constantes pour tous les spectres dans cet exemple : 2,3 nucléotides par charge. Les spectres de masse d'oligonucléotides plus courts contenaient généralement une gamme complète d'ions fragments discernables, quelle que soit l'énergie HCD. L'énergie HCD a eu un effet plus important sur les oligonucléotides plus longs ; des énergies plus basses ne produisaient pas des niveaux adéquats d'ions fragments productifs pour le séquençage. Au fur et à mesure que l'énergie HCD augmente, les ions fragments terminaux 5 '(a, b, c, d) et 3' (w, x, y, z) susceptibles d'être séquencés augmentent en abondance. L'énergie HCD est positivement corrélée avec l'abondance des ions fragments internes, de sorte qu'une énergie HCD supérieure à 25 n'est pas recommandée. Le discernement de la séquence est perdu à partir du milieu des oligonucléotides lorsque des fragments terminaux plus longs sont encore fragmentés en fragments internes. Cette tendance se poursuit à mesure que l'énergie HCD augmente et seuls les oligonucléotides les plus courts subsistent, dont certains sont de courts fragments terminaux. Une énergie HCD de 21 a produit un équilibre idéal d'ions de fragments terminaux relativement abondants pour le séquençage et l'atténuation de la fragmentation interne.

La couverture des ions fragmentés MS/MS a également été étudiée en fonction de l'état de charge et de la longueur de l'oligonucléotide (Fig. 4C). L'énergie HCD est maintenue constante à la condition recommandée d'énergies de collision HCD étagées : 17, 21, 25. Pour toutes les longueurs d'oligonucléotides, les états de charge les plus faibles produisent généralement la couverture d'ions fragment la plus faible, et les états de charge les plus élevés produisent généralement l'ion fragment le plus élevé. couverture. Les ions fragmentés d'un précurseur d'état de charge inférieur peuvent permettre une couverture de séquence supplémentaire à une position spécifique dans certains cas pour deux raisons principales : (1) l'état de charge supérieur a une abondance significativement plus faible qu'un état de charge inférieur et/ou (2) un état de charge supérieur. les ions fragments chargés se chevauchent avec des ions fragments moins chargés, confondant l'identité des deux.

Nous avons observé que l'augmentation de la densité de charge des oligonucléotides avait un effet positif sur la fragmentation permettant le séquençage. Par exemple, l'état de charge [M-4H] -4 du 7-mer (1, 75 nucléotides / charge) produit des ions fragments abondants et une couverture complète des ions fragments (figure 4C). Cependant, l'état de charge [M-4H]-4 du 21-mer (5,25 nucléotides/charge) produit des ions fragments relativement faibles, ne permettant que le séquençage des premiers nucléotides à chaque extrémité. Ce phénomène est plus prononcé lorsque la longueur de l'oligonucléotide augmente. Le séquençage MS/MS d'oligonucléotides avec des densités de charge < ~ 2,5 combiné avec HCD étagé 17, 21, 25 a fourni une fragmentation appropriée sur la carte oligonucléotidique. Heureusement, les conditions IP RP-UHPLC-ESI MS génèrent des états de charge progressivement plus élevés avec l'élution ultérieure d'oligonucléotides plus gros ; ceci maintient une densité de charge idéale pour le séquençage MS/MS. Typiquement, peu de valeur a été ajoutée par le séquençage MS/MS de deux états de charge différents du même oligonucléotide.

La fragmentation optimale du HCD a permis une différenciation réussie de presque tous les isomères de séquence dans la carte des oligonucléotides. La figure 5 le montre avec un scénario difficile mais courant. Trois isomères de séquence sont représentés dans un chromatogramme ionique extrait (Fig. 5A). L'isomère "2" éluant à 75 min coélue avec d'autres oligonucléotides de masse très similaire (Fig. 4C), ce qui augmente le risque d'isoler deux oligonucléotides non apparentés pour produire un spectre MS/MS mixte. La carte oligonucléotidique utilise une fenêtre d'isolement MS/MS (1,5 m/z) qui équilibre la nécessité de minimiser les incidences de spectres mixtes (Fig. 5B et C) et d'échantillonner la distribution isotopique pour permettre la détermination de l'état de charge des ions fragments. Les isomères de séquence "1" et "2" sont très similaires, ne différant que par un seul échange des 3ème et 6ème nucléotides (Fig. 5C). Par conséquent, leurs spectres MS/MS sont très similaires, mais quelques ions fragments clés distinguent chaque isomère de séquence.

Une fragmentation et une interprétation MS/MS appropriées sont essentielles pour la cartographie des oligonucléotides. (A) Chromatogramme ionique extrait de 3 isomères de séquence oligonucléotidique ([M-4H]4-). (B) Spectres de masse à balayage complet des isomères de séquence "1" et "2" ([M-4H]4−) comme indiqué dans le panneau (A). L'ombrage bleu définit la fenêtre d'isolation des précurseurs utilisée pour la fragmentation MS/MS ultérieure. (C) Spectres de fragmentation MS/MS dérivés des isomères de séquence "1" et "2" ([M-4H]4-). (D) Sections agrandies des isomères de séquence "1" et "2" ([M-4H]4−) dans les spectres MS/MS, avec annotation des ions fragments sélectionnés 5' et 3'. Les 1ère, 2ème et 3ème colonnes du volet des fragments MS/MS 5′ observés (en haut) mettent en évidence les fragments 5′ identifiés pour les positions 2, 3 et 6, respectivement. Les 1ère, 2ème et 3ème colonnes du volet des fragments MS/MS 3′ observés (en bas) mettent en évidence les fragments 3′ identifiés pour les positions 1, 2 et 5, respectivement. Pour chaque panneau, l'étiquette "divergente" indique que les masses des mêmes ions de fragment entre les séquences isomères "1" et "2" divergent à cette position, indiquant qu'elles contiennent des nucléotides différents à cette position. L'étiquette "convergente" indique que les masses des mêmes fragments d'ions entre les isomères de séquences "1" et "2" convergent à cette position, indiquant à nouveau qu'ils contiennent des nucléotides différents à cette position. Le codage couleur des pics spectraux est défini dans la clé. L'ombrage coloré unique de chaque flèche mettant en évidence les ions fragmentaires correspond aux couleurs définies dans le panneau (E). (E) Tableaux de masse d'ions fragment observés pour les isomères de séquence "1" et "2" ([M-4H]4-). Un ombrage coloré unique définit chaque type d'ion fragment 5 'et sa paire 3' et correspond aux flèches ombrées dans le panneau (D). L'ombrage bleu foncé met en évidence les deux bases qui changent de position entre les deux isomères de séquence. L'ombrage gris met en évidence les masses d'ions fragments qui différencient les deux isomères de séquence l'un de l'autre.

En lisant à partir de l'extrémité 5 '(Fig. 5D et E), les ions fragments terminaux se terminant aux positions 1 et 2 ont des masses identiques pour chaque isomère de séquence. Les ions fragments terminaux se terminant aux positions 3 à 5 ont des masses uniques et divergentes dans chaque isomère de séquence, indiquant une différence de séquence en position 3. Les ions fragments terminaux se terminant en position 6 convergent en masse, indiquant une autre différence de séquence entre les isomères de séquence en position 6 .

En lisant à partir de l'extrémité 3 '(Fig. 5D et E), les ions fragments terminaux en position 1 ont des masses identiques pour chaque isomère de séquence. Les ions fragments terminaux se terminant aux positions 2 à 4 ont des masses uniques pour chaque isomère de séquence, indiquant une différence de séquence en position 2. Les ions fragments terminaux se terminant en position 5 convergent en masse, indiquant une autre différence entre les isomères de séquence en séquence en position 5.

Dans les deux cas, la détection des différences de séquence repose sur la présence d'une échelle complète d'ions fragmentaires. La fragmentation MS/MS par cartographie oligonucléotidique a produit des échelles d'ions fragment complémentaires complètes pour la plupart des isomères de séquence, permettant leur identification sans ambiguïté et témoignant de la pertinence des paramètres pour la cartographie oligonucléotidique.

L'analyse complète et haute fidélité des données de cartographie des oligonucléotides nécessite une automatisation pour une facilité d'utilisation et une efficacité pratiques. Des scripts internes Excel Visual Basic pour Applications (VBA) combinés à des logiciels bêta et commerciaux en développement ont été utilisés pour automatiser l'analyse des données de la cartographie des oligonucléotides. Ensemble, ces outils ont facilité la caractérisation complète de la structure primaire de BNT162b2 Original via la cartographie des oligonucléotides avec une annotation complète des pics UV et une couverture de séquence maximale de 100 %.

Un script Excel VBA personnalisé a automatiquement corrélé les oligonucléotides identifiés par LC-MS/MS à leur fonction LC-UV correspondante et annoté automatiquement l'intégralité du chromatogramme UV (les données supplémentaires de la Fig. 6 illustrent l'ensemble du flux de travail). Les identifications ont été fournies par l'une des deux méthodes : (1) 280 oligonucléotides sur 388 (72 %) ont été identifiés par BioPharma Finder (Thermo Fisher Scientific), (2) 108 sur 388 (28 %) ont été identifiés à l'aide de scripts Excel VBA personnalisés. Les scripts ont facilité l'identification semi-automatique des oligonucléotides par la procédure suivante : (1) les masses de précurseurs observées associées à des caractéristiques LC-UV non identifiées ont été appariées à d'éventuels oligonucléotides de digestion théoriques, (2) pour chaque pic MS/MS empirique inconnu m/z les coordonnées d'intensité, la masse observée, l'état de charge et un oligonucléotide hypothétique de la liste des candidats ont été entrés dans un analyseur de spectre MS/MS, (3) un spectre MS/MS annoté et le tableau de séquençage correspondant ont été générés automatiquement, (4) le MS/ La correspondance de séquençage MS pour l'oligonucléotide hypothétique a été examinée par un analyste, confirmant ou rejetant l'identification.

L'analyse des données de cartographie des oligonucléotides est mise au défi par l'abondance d'isomères de séquence qui ont des spectres MS/MS très similaires. Il existe également une forte probabilité que de nombreux produits de digestion de la RNase T1 pour une grande construction cible (par exemple ~ 1 + MDa) aient des masses identiques et une similitude de séquence élevée avec les produits de digestion d'autres constructions de taille et de composition similaires. Par exemple, la séquence inverse de BNT162b2 a le même nombre de produits de digestion in silico RNase T1 que la séquence directe ; mais seulement 26 % d'entre eux ont la même séquence (Fig. 6A). Cependant, 99 % ont la même masse (Fig. 6B), ce qui rend la MS/MS de haute qualité et l'interprétation haute fidélité de ces spectres critiques pour leur identification et l'identification de la construction correcte.

Technique de recherche de séquence leurre développée comme une évaluation d'adéquation pour le flux de travail de cartographie d'oligonucléotides. (A) Diagramme de Venn des fragments d'oligonucléotides partagés et uniques d'une digestion théorique par la RNase T1 de la construction originale BNT162b2 et de sa construction à séquence inverse. Ceci est un exemple de construction leurre. La digestion théorique prédit 302 oligonucléotides à séquence unique (74 %) pour chacun et 78 oligonucléotides partagés (26 %). (B) Diagramme de Venn des fragments d'oligonucléotides de masse partagée et de masse unique d'une digestion théorique par la RNase T1 de la construction originale BNT162b2 et de sa construction de séquence de réserve. La digestion théorique prédit 147 oligonucléotides de masse unique pour chacun. Parmi ceux-ci, 145 oligonucléotides (99 %) sont partagés. (C) Superposition d'identification de la construction leurre sur le chromatogramme ionique de pointe de base de l'acquisition de la digestion originale de la RNase T1 BNT162b2. Chaque barre colorée marque une caractéristique oligonucléotidique identifiée par le logiciel automatisé BioPharma Finder comme provenant de la digestion RNase T1 d'une construction leurre. Les constructions leurres sont des séquences aléatoires contenant la composition nucléotidique de BNT162b2 Original. La région d'élution de séquence commune contient des oligonucléotides plus courts, dont la plupart sont communs à toutes les constructions leurres ainsi qu'à la vraie construction lorsqu'elle est soumise à une digestion par la RNaseT1. La région d'élution de séquence unique contient des oligonucléotides plus longs, dont la plupart sont uniques à la vraie construction. Les véritables oligonucléotides construits sont suffisamment similaires aux oligonucléotides de séquence leurre pour que le logiciel automatisé fournisse des attributions d'oligonucléotide leurre. Les identifications dans la région d'élution de séquence unique ne sont pas préférentiellement attribuées à une seule construction leurre, démontrant qu'aucune des constructions leurres n'est la vraie construction. (D) Superposition d'identification de la construction cible et leurre sur le chromatogramme ionique de pointe de base de l'acquisition de la digestion originale de la RNase T1 BNT162b2. Chaque barre colorée marque une caractéristique oligonucléotidique identifiée par le logiciel automatisé BioPharma Finder comme provenant de la digestion RNase T1 d'un leurre ou d'une construction cible. Les oligonucléotides dans la région d'élution à séquence unique sont principalement identifiés (> 95 %) comme appartenant à la construction originale BNT162b2. Cela confirme l'identité de la véritable construction et vérifie la capacité du flux de travail de cartographie des oligonucléotides à identifier correctement les oligonucléotides via LC-MS/MS.

En raison de ce défi, une évaluation d'adéquation effectuée à grande échelle est nécessaire pour l'analyse automatisée des données d'oligonucléotides. La première étape de la stratégie illustre également le problème inhérent. L'identification automatisée des oligonucléotides BNT162b2 est effectuée contre des constructions leurres générées par brouillage aléatoire de la séquence (Fig. 6C). La plupart des oligonucléotides éluant dans la "région de séquence unique" ne peuvent être générés que par digestion à la RNase T1 de la vraie construction, par opposition aux oligonucléotides de la "région de séquence commune" qui sont communs aux digestions in silico de la vraie construction et d'une ou plusieurs constructions leurres . De nombreux oligonucléotides uniques sont similaires aux oligonucléotides de digestion RNase T1 in silico d'une ou plusieurs constructions leurres, de sorte que le logiciel attribue consciencieusement une identification (bien qu'incorrectement). Cela se produit parce que le critère de correspondance des ions précurseurs MS est rempli et qu'il existe suffisamment de preuves MS/MS pour étayer une identification de séquence raisonnable. Il est important de noter que l'omission de la construction BNT162b2 de la recherche de leurre (figure 6C) entraîne l'attribution d'oligonucléotides à un mélange comparable des trois constructions de leurre. En revanche, la plupart des oligonucléotides dans la "région de séquence unique" sont attribués à la construction BNT162b2 lorsqu'ils sont recherchés en tandem avec les constructions leurres, révélant qu'il s'agit de la véritable construction (Fig. 6D). Cette lecture est une validation que le flux de travail combiné de (1) digestion enzymatique à une seule enzyme, (2) séparation chromatographique, (3) fragmentation MS/MS HCD et (4) analyse de données semi-automatisée convient à l'ARNm caractérisation de la structure primaire.

Bien que le logiciel automatisé utilisé dans cette étude, BioPharma Finder, permette une vérification globale de la fidélité par recherche de leurre, pour les correspondances MS/MS individuelles, il ne fournit pas de classement des meilleures et des meilleures correspondances suivantes, ni une probabilité d'appariement dérivée de son score de confiance. Pour recouper les affectations MS/MS individuelles, nous avons également utilisé le progiciel Pytheas accessible au public32. Dans cette comparaison, il n'a pas été possible de faire correspondre des correspondances de spectre de fragment unique entre les logiciels ; au lieu de cela, les temps de rétention des identifications de même oligonucléotide ont été comparés. Les temps de rétention ne correspondent pas parfaitement car Pytheas n'interprète que MS/MS, de sorte que le temps de rétention d'une identification est basé sur son temps d'événement de balayage MS/MS, alors que BioPharma Finder extrait les chromatogrammes d'ions précurseurs et associe une identification MS/MS à le temps de rétention au sommet des ions extraits précurseurs. Néanmoins, le coefficient de corrélation de 0,9997 et la pente de 0,9993 de l'ajustement linéaire au tracé des temps de rétention (Pytheas, BioPharma Finder) des 280 oligonucléotides identifiés par BioPharma Finder prouvent que les deux logiciels sont en accord avec presque toutes les identifications d'oligonucléotides (Données supplémentaires Fig. 7). Cette analyse soulève une observation importante : lorsque les caractéristiques LC ne sont pas composées d'isomères de séquence, les logiciels automatisés BioPharma Finder et Pytheas identifient également bien les oligonucléotides. Lorsque les caractéristiques LC sont des pics de mélange d'isomères de séquence, aucun logiciel n'identifie bien les oligonucléotides (la caractéristique est soit non identifiée (BioPharma Finder) soit mal identifiée (Pytheas)), et l'analyste doit sauver l'identification par une interprétation minutieuse du spectre à l'aide d'un logiciel d'appariement de spectre individuel tel que que les feuilles de calcul Excel prenant en charge les macros fournies dans cette étude.

La cartographie LC-MS/MS-oligonucléotide a été développée pour fournir une caractérisation directe et complète de la structure primaire de l'ARNm pour le vaccin Comirnaty BNT162b2 contre le SRAS-CoV-2. À l'aide d'une enzyme, la RNase T1, la méthode a atteint une couverture de séquence maximale de 100 % et une détection sensible des formes terminales 5 'et 3', confirmant ainsi l'intégrité structurelle de la molécule de pleine longueur prévue en une seule méthode. Le nombre de répétitions de séquences d'oligonucléotides dans l'ARNm est répandu après la digestion par la RNase T1, mais la méthode a digéré et détecté de manière stoechiométrique ces espèces, augmentant la couverture de séquence unique de 56 %. L'évaluation systématique des paramètres MS/MS a conduit à une différenciation fiable des isomères de séquence, qui sont également répandus dans l'ARNm digéré, pour une augmentation supplémentaire de la couverture de séquence maximale. Enfin, une technique de recherche d'analyse de données de séquence leurre a été développée pour assurer la confiance dans l'attribution automatisée d'oligonucléotides. Dans l'ensemble, la méthode de cartographie LC-MS/MS-oligonucléotide décrite ici améliore les méthodes existantes en (1) fournissant une méthode de digestion de nucléase robuste et unique disponible dans le commerce ; (2) en veillant à ce que les MS/MS les plus informatifs sur le séquençage soient acquis à l'aide d'une fragmentation HCD optimisée ; (3) fournir une simple évaluation de l'adéquation de la recherche leurre pour s'assurer que le logiciel automatisé interprète correctement MS/MS ; (4) fournir un outil pour permettre l'annotation correcte du chromatogramme LC-UV complexe « d'empreintes digitales » et (5) fournir des outils d'interprétation du spectre MS et MS/MS pour vérifier les identifications logicielles automatisées et identifier les pics de mélange d'isomères inconnus et séquentiels.

Nous recommandons une évaluation pratique de l'adéquation pour évaluer l'ensemble du flux de travail LC-MS/MS, y compris l'analyse automatisée des données (Fig. 6C et D). Cette stratégie de recherche de leurres est analogue à ce qui a longtemps été effectué pour l'inférence protéique dans les analyses protéomiques33. Cette méthode de cartographie oligonucléotidique n'est pas une méthode "-omique" ; quelle que soit l'hétérogénéité des extrémités 3 'et 5', DS est une construction unique, pas un mélange complexe de milliers de molécules d'ARN. Néanmoins, la recherche de leurres qui permet d'évaluer la qualité de la correspondance MS/MS par une comparaison spectrale relative est appropriée, car les isomères de séquence d'une même construction peuvent avoir des schémas de fragmentation très similaires - et il existe de nombreux isomères de séquence : 220 des 302 ARNm BNT162b2 RNase théorique T1 digérer les oligonucléotides.

Un autre aspect prometteur de cette approche MS est qu'en caractérisant directement l'ARN, les sites de dégradation par hydrolyse du phosphodiester et les sites de transcription incomplète peuvent également être catalogués et ensuite surveillés pour comprendre les voies de dégradation du DS. De plus, il est possible de détecter des oligonucléotides issus de la transcription de la région non cible du plasmide ADN (bien que cela n'ait pas été observé dans cette étude). Enfin, cette méthode de cartographie oligonucléotidique pourrait être davantage optimisée et appliquée pour caractériser les modifications spécifiques au site, y compris les adduits ARNm-lipides34 et d'autres effets possibles.

Il existe d'autres bonnes stratégies pour augmenter le nombre d'oligonocléotides uniques dans la carte de l'ARN, soit en favorisant les clivages manqués de la RNase T1 dans une digestion limitée, soit en utilisant des endonucléases avec des sites de substrat à basse fréquence, tels que MazF et RNase 418,19,35. La méthodologie d'analyse des données détaillée ici devrait fonctionner aussi bien, et de plus peut être nécessaire car l'identification des composants de pic de mélange est un problème indépendant de l'unicité de l'oligonucléotide (bien qu'il devrait y avoir moins de pics de mélange).

La cartographie oligonucléotidique et le séquençage de nouvelle génération (NGS) sont de puissantes méthodes de caractérisation orthogonale pour la détermination de la structure primaire de l'ARNm. Les deux techniques ont des avantages distincts. NGS peut déterminer efficacement la séquence nucléotidique contiguë avec plusieurs lectures (Données supplémentaires Fig. 8), ainsi que détecter et identifier tout ADN/ARN contaminant. La cartographie oligonucléotidique est utilisée pour confirmer l'intégrité structurelle de la molécule d'ARNm entière, y compris la séquence nucléotidique, le degré d'extrémité 5 'coiffée et non coiffée et la microhétérogénéité de la région de queue poly (A). Il ajoute également une capacité vitale pour évaluer la comparabilité des lots après les changements de processus de fabrication et de site. Il peut être utilisé pour distinguer différentes constructions d'ARNm en tant que test d'identité. Aucun contrôle spécifique à la méthode n'a besoin d'être synthétisé et maintenu (comme les contrôles marqués par des isotopes lourds).

La méthode de cartographie oligonucléotidique décrite ici impliquant une digestion de RNase T1 de 1,5 h et IP-RP-UHPLC-UV-MS/MS a été utilisée dans le développement et la commercialisation du vaccin Comirnaty BNT162b2 contre le SRAS-CoV-2. La compréhension des processus et des produits tirée de la cartographie des oligonucléotides a soutenu à la fois les demandes d'autorisation d'utilisation d'urgence (EUA) et de demande de licence de produits biologiques (BLA) et a contribué à l'évaluation globale de la qualité, de l'innocuité et de l'efficacité du produit. De même, la cartographie des oligonucléotides a fait partie de nombreux exercices de comparabilité aidant à démontrer que la meilleure qualité de produit a été maintenue à mesure que les échelles de production ont été augmentées et que de nouveaux sites de fabrication ont été mis en ligne pour relever le défi d'approvisionnement critique de la pandémie de COVID-19. Notre intention est que cette méthode accélère le développement et les soumissions réglementaires de vaccins à ARNm et de thérapies géniques bien caractérisés et fasse progresser plus largement la science de la compréhension structurelle de l'ARN.

Les données brutes et un document de méthode détaillé sont fournis dans la plate-forme de données Dryad : https://datadryad.org/stash/share/38WoZ944MVcISX-VQpGNoaXn_4Pwe5nv_ipD707TZF8.

Quatre outils de cartographie et d'identification du logiciel Excel VBA utilisés pour vérifier et augmenter les identifications de Thermo BioPharma Finder et fournir un chromatogramme annoté sont fournis dans la plate-forme de données Dryad : https://datadryad.org/stash/share/38WoZ944MVcISX-VQpGNoaXn_4Pwe5nv_ipD707TZF8. Le document de méthode fourni décrit également les instructions clic par clic pour l'utilisation de chaque fichier.xlsm.

Les constructions d'ARNm analysées ont été fabriquées chez Pfizer. Bien que les séquences soient fournies dans ce manuscrit, il n'est pas possible de rendre disponible le matériel d'ARNm présenté ici.

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Les auteurs remercient nos partenaires de BioNTech, Andreas Kuhn et Julia Schlereth, pour leur soutien et leur communication. Nous remercions notre partenaire de longue date chez Thermo, Jennifer Sutton, de nous avoir permis de collaborer au développement du module d'analyse d'oligonucléotides de BioPharma Finder. Nous remercions Taylor Dufield pour ses contributions à l'optimisation de la méthode. Nous remercions Erika Jensen et Mojgan Kouhnavard pour leur travail mesurant le coefficient d'extinction N1-methylpseudouridine. Enfin, nous remercions les dirigeants de Pfizer Jeff Ryczek, Lisa Marzilli, Justin Sperry et Margaret Ruesch pour leur soutien et leurs conseils lors du développement et de l'application de cette méthode.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Brian C. Gau et Andrew W. Dawdy.

BioTherapeutics Pharmaceutical Sciences, Pfizer Inc, Chesterfield, MO, États-Unis

Brian C. Gau, Andrew W. Dawdy, Hanliu Leah Wang, Bradley Bare, Carlos H. Castaneda, Olga V. Friese et Thomas F. Lerch

BioTherapeutics Pharmaceutical Sciences, Pfizer Inc, Andover, MA, États-Unis

Matthew S. Thompson, David J. Cirelli et Jason C. Rouse

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AD et BG ont contribué à parts égales à ce travail, et la correspondance peut également être adressée à l'un ou aux deux auteurs. Les auteurs tiennent à ce que l'on sache qu'à leur avis, les 2 premiers auteurs doivent être considérés comme co-premiers auteurs. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Brian C. Gau ou Andrew W. Dawdy.

Tous les auteurs sont des employés de Pfizer.

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Réimpressions et autorisations

Gau, BC, Dawdy, AW, Wang, HL et al. Cartographie des oligonucléotides par spectrométrie de masse pour permettre la caractérisation complète de la structure primaire d'un vaccin à ARNm contre le SRAS-CoV-2. Sci Rep 13, 9038 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36193-2

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Reçu : 17 mars 2023

Accepté : 30 mai 2023

Publié: 03 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36193-2

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