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May 06, 2023

Signalisation antivirale par une protéase CRISPR activée par un nucléotide cyclique

Nature tome 614, pages

Nature volume 614, pages 168–174 (2023)Citer cet article

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Les systèmes de défense CRISPR tels que le bien connu Cas9 ciblant l'ADN et les systèmes de type III ciblant l'ARN sont répandus chez les procaryotes1,2. Ce dernier orchestre une réponse antivirale complexe qui est initiée par la synthèse d'oligoadénylates cycliques après reconnaissance d'ARN étranger3,4,5. Parmi le vaste ensemble de protéines liées aux systèmes de type III et censées se lier aux oligoadénylates cycliques6,7, une protéase Lon associée à CRISPR (CalpL) s'est démarquée pour nous. CalpL contient un domaine capteur de la famille SAVED7 fusionné à un domaine effecteur de la protéase Lon. Cependant, le mode d'action de cet effecteur est inconnu. Nous rapportons ici la structure et la fonction de CalpL et montrons que cette protéine soluble forme un complexe tripartite stable avec deux autres protéines, CalpT et CalpS, qui sont codées sur le même opéron. Après activation par le tétra-adénylate cyclique (cA4), CalpL oligomérise et clive spécifiquement l'homologue MazF CalpT, qui libère la fonction extracytoplasmique facteur σ CalpS du complexe. Nos données fournissent un lien direct entre la détection basée sur CRISPR des acides nucléiques étrangers et la régulation transcriptionnelle. De plus, la présence d'un domaine SAVED qui se lie au tétra-adénylate cyclique dans un effecteur CRISPR révèle un lien avec le système de signalisation antiphage à base d'oligonucléotide cyclique.

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Les structures cristallines ont été déposées dans la base de données Protein Data Bank avec les codes d'accession 7QDA, 8B0R et 8B0U. Les données et les modèles SAXS ont été déposés dans la Small Angle Scattering Biological Data Bank avec les codes d'accession SASDQM4, SASDQN4, SASDQP4 et SASDQQ4. Les entrées suivantes de la banque de données sur les protéines ont été utilisées dans cette étude : 2H27, 3K1J, 4ME7, 4IZJ, 4LUP, 5ZX2, 5CR2, 6VM6, 6SCE et 7RWK. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Les données du synchrotron MX ont été collectées sur la ligne de lumière P13, exploitée par le personnel de l'EMBL Hambourg sur l'anneau de stockage PETRA III (DESY, Hambourg, Allemagne). Nous remercions G. Bourenkov et I. Bento pour leur aide dans l'utilisation de la ligne de lumière ; V. Siksnys pour des discussions utiles ; S. Shirran et S. Synowsky pour l'analyse MS ; N. Brenner pour l'assistance technique ; et M. Drag et J. Grzymska pour des discussions et un premier criblage de peptides. MG et JLS-B. sont financés par la Deutsche Forschungsgemeinschaft dans le cadre de la stratégie allemande d'excellence–EXC2151–390873048. MFW reconnaît une subvention avancée du Conseil européen de la recherche (numéro de subvention 101018608) et le China Scholarship Council (référence 202008420207 à HC). BEB reconnaît le financement des équipements EPR par BBSRC (BB/R013780/1 et BB/T017740/1). GH est reconnaissant pour le financement de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (numéro de subvention HA6805/6-1).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Christophe Rouillon, Niels Schneberger

Institut de biologie structurale, Université de Bonn, Bonn, Allemagne

Christophe Rouillon, Niels Schneberger, Jonas Moecking, Martin F. Peter, Matthias Geyer & Gregor Hagelueken

Institut Max Planck de neurobiologie du comportement — Caesar, Bonn, Allemagne

Christophe Rouillon, Wolfgang Boenigk & Reinhard Seifert

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Haotian Chi & Malcolm F. White

Institut de chimie clinique et de pharmacologie clinique, Université de Bonn et hôpital universitaire de Bonn, Bonn, Allemagne

Katja Blumenstock & Jonathan L. Schmid-Burgk

Laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL), site de Hambourg, Hambourg, Allemagne

Stefano Da Vela & Dmitri Svergun

EaStCHEM School of Chemistry, Complexe de recherche en sciences biomédicales et Centre de résonance magnétique, Université de St Andrews, North Haugh, St Andrews, Royaume-Uni

Katrin Ackermann & Bela E. Bode

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CR et GH ont conçu et supervisé l'étude et effectué des expériences initiales d'expression et de cristallisation des protéines à l'aide de CalpL. RS et WB ont cloné la construction CalpL initiale. Expériences conçues par NS, CR, MFW et GH. NS a optimisé la purification de CalpL et CalpT, a cristallisé CalpL, CalpL-cA4 et CalpL-CalpT10 et a établi et réalisé les tests de clivage, les expériences SEC-MALS et DLS. NS et MFP ont cloné toutes les constructions mutantes. GH et NS ont résolu et affiné les structures CalpL, CalpL–cA4 et CalpL–CalpT10. JM et MG ont conçu et réalisé les expériences SPR. HC et MFW ont planifié et effectué les tests de ribonucléase. HC, NS et MFW ont cloné et purifié CalpS et réalisé les expériences de liaison et de co-expression impliquant CalpS. SDV a réalisé les expériences SAXS. SDV et DS ont effectué l'analyse et l'interprétation des données SAXS et rédigé les sections correspondantes. BEB et KA ont réalisé les expériences de RPE pulsée, analysé les données, préparé les figures et rédigé les sections correspondantes. KB et JLS-B. conçu et réalisé les tests de séquençage de la RNase. CR, MFW, HC, NS et GH ont analysé les données et rédigé l'article. Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit à toutes les étapes.

Correspondence to Christophe Rouillon or Gregor Hagelueken.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Simon Jackson, David Taylor et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Chromatographie par Gelfiltration (Superdex 200 16/60) de CalpL. En médaillon : analyse SDS-PAGE des fractions indiquées par la barre bleue dans le chromatogramme. L'expérience a été réalisée plusieurs fois (n> 3 répétitions biologiques). b, TM-prédiction par le serveur TMHMM 2.028 vs structure expérimentale. c, Densité électronique représentative de la structure cristalline SeMet CalpL. Le modèle structurel est dessiné en représentation boule-et-bâton. Les résidus sélectionnés sont étiquetés. Le maillage noir est une carte de densité électronique 2mFo-DFc profilée à 1,0 σ. d, diagramme de topologie de CalpL. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

Données source

a, CalpL est dessiné comme un modèle de dessin animé avec un code couleur comme sur la Fig. 1. La protéase Lon de T. onnorineus (PDB-ID : 3K1J, DALI Z-score : 12,8)76 est représentée comme un modèle de dessin animé blanc. b, Tableau répertoriant les protéines avec des structures de domaine similaires17,23,27,29,30,76,77,78. c, Électrostatique de surface de la région du site actif de la protéase Lon. La dyade catalytique est marquée. La ligne grise marque le site de liaison probable du substrat. d, superposition du site actif de CalpL avec l'intermédiaire acyl-enzyme de la protéase du virus de l'asciite à nageoires jaunes. CalpL est représenté par des bâtons et codé par couleur comme sur la figure 1. La chaîne D de la structure 4IZJ27 (résidus 630–640) a été superposée aux résidus correspondants de CalpL (150-160) conduisant à une rmsd de 0,314 Å. De 4IZJ, seul l'intermédiaire acyl-enzyme est représenté en mode sticks. Les résidus sélectionnés et les positions des sites P1-P3 sont indiqués. e, Superposition de CalpL (schéma de couleurs comme sur la Fig. 1) avec la protéine Cap4 (blanc, PDB-ID : 6VM6)23. f, Superposition du domaine CalpL SAVED (schéma de couleurs comme sur la Fig. 1) avec la protéine Can1 (blanc, PDB-ID : 6SCE)17. g, Superposition du domaine CalpL SAVED (schéma de couleur comme sur la Fig. 1) avec les domaines CARF de la protéine Cap5 (blanc, PDB-ID : 7RWK)29.

a, gros plan de cA4 (vert) lié au domaine SAVED de CalpL. Le maillage bleu est une carte de densité électronique 2mFo-DFc profilée à 1,0 σ. b, Superposition de CalpL apo (blanc) sur la structure complexe cA4 (code couleur comme sur la Fig. 1). c, alignement structurel des domaines SAVED de CALP/cA4 et Cap4/cA3 (blanc).

a, b, Une superposition de la structure CalpT prédite (comparer la Fig. 2B) avec un monomère du complexe MazF/ssRNA (violet/orange) (PDB-ID : 5CR2)79. La confiance de la prédiction AlphaFold233 est mappée sur la structure CalpT (pLDDT48, test de différence de distance locale prédite). b, Une superposition de la structure prédite de CalpT (comparer Fig. 2b) avec un monomère du complexe MazE/F (PDB-IDs : 4ME7)35. La confiance de la prédiction AlphaFold233 est mappée sur la structure CalpT (pLDDT48, test de différence de distance locale prédite). c, Chromatographie par filtration sur gel (Superdex 75 16/60) de CalpT L'expérience a été réalisée plusieurs fois (n > 3 répétitions biologiques). Selon les données MALS de la figure 3, la CalpT isolée se comporte comme un monomère. Encart : analyse SDS-PAGE des fractions indiquées par la barre bleue. d, empreintes peptidiques des bandes de clivage. Les bandes de gel indiquées ont été coupées du gel et soumises pour identification à l'installation de spectrométrie de masse et de protéomique de l'Université de St Andrews (Fife, Royaume-Uni, https://mass-spec.wp.st-andrews.ac.uk) . Les lettres rouges indiquent les peptides qui ont été identifiés dans l'échantillon respectif. L'expérience a été réalisée une fois. e, analyse mutationnelle des sites de clivage potentiels de CalpL dans CalpT. L'expérience a été réalisée plusieurs fois (n> 3 répétitions techniques). Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

Données source

a, données SPR de cinétique à cycle unique de l'interaction CalpL/T. L'interaction est très forte mais ne peut pas être ajustée de manière satisfaisante avec un modèle de liaison 1:1. L'expérience a été réalisée deux fois (n = 2 répétitions techniques). b, comme a), mais une construction artificielle d'un VHH non spécifique fusionné à CalpT a été utilisée comme analyte dans cette expérience. L'interaction est très similaire à l'interaction CalpL/T. L'expérience a été réalisée deux fois (n = 2 répétitions techniques). c, schémas de deux constructions artificielles contenant le site de clivage CalpL. d, CalpL clive une construction artificielle d'un VHH non spécifique fusionné à CalpT10 mais pas une construction de deux VHH fusionnés par le site de clivage de CalpL. L'expérience a été réalisée une fois. e, traces SEC-MALS (lignes pleines : UV280, lignes pointillées : MWMALS) de réactions de protéolyse avec différentes combinaisons de CalpL S152A, CalpT et cA4. Le schéma indique les espèces moléculaires derrière les pics individuels. Les expériences ont été réalisées deux fois avec des conditions de tampon légèrement différentes (n = 2 répétitions techniques). f, liaison de CalpL wt aux mutants CalpT indiqués en l'absence de cA4. Le schéma indique la position du mutant dans le complexe CalpL/T. Les expériences ont été réalisées une fois. g, densité électronique représentative de la structure cristalline CalpL/T10. Les résidus sélectionnés sont étiquetés. Le maillage noir est une carte de densité électronique 2mFo-DFc profilée à 1,0 σ. h, expérience SEC-SAXS du complexe CalpL/T10. L'expérience a été réalisée une fois. Trente cadres d'intensité d'échantillon et soixante cadres d'intensité de tampon ont été collectés et moyennés. Pour chaque ensemble de données et point angulaire, les erreurs ont été calculées selon la statistique de Poisson. Les points de données représentent la différence d'intensité moyenne (échantillon-tampon) et les barres d'erreur représentent l'écart type. Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

Données source

a, Expériences de diffusion dynamique de la lumière (six séries chronologiques, chaque série marquée par un cercle en pointillés, des points de données uniques sont affichés) à différentes concentrations de protéines et en l'absence (t = 0 : gris clair à t = 60 min : gris foncé) et présence (t = 0 : cyan à t = 60 min : violet) de cA4 révèlent une oligomérisation dépendante de cA4 de CalpL. L'expérience a été réalisée deux fois (n = 2 répétitions techniques) b, expériences SAXS à différentes concentrations. Les expériences ont été réalisées une fois. Pour chaque expérience, trente cadres d'intensité d'échantillon et soixante cadres d'intensité de tampon ont été collectés et moyennés. Pour chaque ensemble de données et point angulaire, les erreurs ont été calculées selon la statistique de Poisson. Les points de données représentent la différence d'intensité moyenne (échantillon-tampon) et les barres d'erreur représentent l'écart type. c, Modèle ab initio/corps rigide d'un dimère CalpL créé avec DAMMIF et SASREFMX par un ajustement global d'un mélange monomère-dimère aux différentes concentrations (lignes rouges). La structure cristalline du monomère CalpL est représentée à la même échelle.

Données source

a, image de fluorescence de la PAGE dénaturante pour déterminer l'activité ribonucléase des réactions en b) contre six substrats d'ARN marqués par fluorescence (énumérés en c)). Aucun clivage n'a été observé après 30 min d'incubation avec des ARN à 60 °C. L'expérience a été réalisée trois fois (n = 3 réplicats biologiques) b, analyse SDS-PAGE du clivage induit par cA4 de CalpT (33 kDa) par CalpL. Le clivage est complet après 60 min à 60 °C. L'expérience a été réalisée trois fois (n = 3 répétitions biologiques) c, Séquences des substrats d'ARN d, à gauche : MazF a été incubé avec une banque d'ARN simple brin contenant 10 bases aléatoires. Le séquençage Illumina a été utilisé pour vérifier les séquences clivées par MazF. Par rapport à une réaction témoin sans MazF, les séquences contenant le site cible MazF connu (ACA) ont été appauvries. à droite : même expérience mais avec CalpL/T ± cA4 au lieu de MazF. Aucune séquence hors diagonale et donc aucune activité ssRNase n'ont été observées. L'expérience a été réalisée deux fois (n = 2 répétitions biologiques). e, oligonucléotides pour les expériences en d) f, modèles dimères AlphaFold2 de CalpT23. g, Meilleur modèle (pLDDT48, test de différence de distance locale prédite) incluant l'étiquette de spin MTSSL80. h, spectre EPR cw en bande X de CalpL/T E119R1. La quantité d'étiquette libre (pointes acérées) est d'environ 10 %. L'efficacité de l'étiquetage déterminée à ~100 %. i, PELDOR traces temporelles de CalpL/T E119R1 en présence (rouge) et en absence (noir) de cA4. j, Distributions de consensus et bandes d'incertitude correspondantes. Les barres colorées indiquent les plages de fiabilité (vert : forme fiable ; jaune : moyenne et largeur fiables ; orange : moyenne fiable ; rouge : pas de quantification possible). Distance prévue calculée avec mtsslWizard80. L'expérience EPR a été réalisée deux fois (n = 2 répétitions techniques). Pour les données de source de gel, voir la Fig. 1 supplémentaire.

Données source

a, Prédiction de CalpS seul. La protéine est représentée sous forme de bande dessinée et colorée selon la confiance de prédiction (pLDDT48, test de différence de distance locale prédite) b, Prédiction du complexe CalpT/S. c, la superposition de CalpS avec 4LUP81 et 2H2782 identifie les régions de liaison à l'ADN de CalpS. d, Modèle de CalpS dans le contexte d'un complexe facteur σ/promoteur RNAP/ECF (PDB : 5ZX283, gris, jaune, vert) de M. tuberculosis. Notez que la région de liaison entre les sous-unités σ2 et σ4 de CalpS a été coupée pour permettre la superposition des domaines σ2 et σ4 sur ceux de 5ZX2. Le lieur est suffisamment long pour se lier au RNAP de la même manière que le facteur σ dans la structure 5ZX2 (jaune).

Versions non recadrées et non éditées de tous les gels utilisés dans cette étude.

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Réimpressions et autorisations

Rouillon, C., Schneberger, N., Chi, H. et al. Signalisation antivirale par une protéase CRISPR activée par un nucléotide cyclique. Nature 614, 168-174 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

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Reçu : 06 décembre 2021

Accepté : 17 novembre 2022

Publié: 24 novembre 2022

Date d'émission : 02 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

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