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May 16, 2023

Potentiel du système CRISPR/Cas en tant qu'outils émergents dans la détection de l'hépatite virale

Journal de virologie

Virology Journal volume 20, Article number: 91 (2023) Citer cet article

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L'hépatite virale, la cause la plus fréquente de maladie inflammatoire du foie, touche des centaines de millions de personnes dans le monde. Il est le plus souvent associé à l'un des cinq virus de l'hépatite nominaux (virus de l'hépatite A à E). Le VHB et le VHC peuvent provoquer des infections aiguës et des infections chroniques persistantes tout au long de la vie, tandis que le VHA et le VHE provoquent des infections aiguës spontanément résolutives. Le VHA et le VHE se transmettent principalement par voie féco-orale, tandis que les maladies transmises par les autres formes sont des maladies à diffusion hématogène. Malgré le succès du traitement des hépatites virales et le développement des vaccins contre le VHA et le VHB, il n'existe toujours pas de diagnostic précis au niveau génétique pour ces maladies. Le diagnostic rapide de l'hépatite virale est une condition préalable à une intervention thérapeutique efficace. En raison de la spécificité et de la sensibilité de la technologie de séquences palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR)/CRISPR-associated sequences (Cas), elle a le potentiel de répondre aux besoins critiques dans le domaine du diagnostic des maladies virales et peut être utilisée de manière polyvalente. applications de diagnostic de soins (POC) pour détecter les virus avec des génomes d'ADN et d'ARN. Dans cette revue, nous discutons des avancées récentes des outils de diagnostic CRISPR-Cas et évaluons leur potentiel et leurs perspectives dans des stratégies rapides et efficaces pour le diagnostic et le contrôle de l'hépatite virale.

L'hépatite virale, une infection qui provoque une inflammation du foie, est un problème de santé mondial important. Il existe de nombreux virus connus pour provoquer une inflammation du foie, notamment le virus de l'herpès simplex (HSV), le cytomégalovirus (CMV), le virus d'Epstein-Barr (EBV) et le virus varicelle-zona (VZV) [1]. Cependant, les agents responsables les plus fréquents de cette affection sont les virus hépatotropes, notamment le virus de l'hépatite A (VHA), le virus de l'hépatite B (VHB), le virus de l'hépatite C (VHC), le virus de l'hépatite delta (VHD) et le virus de l'hépatite E (VHE). ), qui conduisent à une infection aiguë ou chronique [2]. Ces virus du foie comprennent une variété de virus à ADN et à ARN de différentes familles virales qui se propagent par différentes voies de transmission [3]. À l'échelle mondiale, l'hépatite virale cause environ 1,4 million de décès chaque année. En termes de mortalité, le VHB et le VHC figurent parmi les quatre principales menaces infectieuses au monde, à égalité avec le VIH, le paludisme et la tuberculose [4, 5]. Les symptômes cliniques de l'hépatite virale varient de symptômes tels que l'hépatite asymptomatique à l'hépatite aiguë, l'insuffisance hépatique aiguë, l'hépatopathie chronique et même le développement de résultats liés au foie, y compris le carcinome hépatocellulaire (CHC) chez différents patients [6]. Malgré certaines avancées médicales dans le traitement de l'hépatite et la mise au point de vaccins contre le VHA et le VHB, il existe encore de grandes lacunes dans le diagnostic génétique précis des hépatites virales. Un diagnostic précoce et précis de l'hépatite virale et une évaluation précoce de son pronostic sont essentiels pour le traitement et les soins efficaces des personnes touchées [7]. La technologie émergente d'édition de gènes, CRISPR/Cas, a le potentiel de combler ces lacunes techniques. Le système CRISPR/Cas est attrayant pour une large gamme d'applications diagnostiques et thérapeutiques avec une efficacité élevée et des conceptions programmables [8]. Les locus CRISPR ont été découverts pour la première fois dans E. coli en 1987, suivis de l'identification de protéines dépendantes de CRISPR. Des recherches ultérieures ont montré que CRISPR servait de mécanisme de défense dans les cellules procaryotes contre les éléments génétiques exogènes, y compris les pathogènes viraux et les plasmides, par une dégradation précise et spécifique de leurs séquences [9, 10]. Le système CRISPR-Cas est divisé en deux catégories principales, les classes I et II, qui comprennent six types et quarante-huit sous-types [11]. La classe I comprend les types I, III et IV, qui sont associés aux enzymes Cas3, Cas10 et Cas8-like (csf1), respectivement, et utilisent l'ARN CRISPR (ARNcr) avec un ensemble de protéines Cas pour identifier et éliminer le cibler les éléments génétiques. La classe II du système CRISPR comprend les types II, V et VI, qui contiennent respectivement les protéines Cas9, Cas12 et Cas13, et utilise l'ARNc et une seule protéine Cas multi-domaine pour sa fonction [12,13,14,15, 16]. Dans cette revue, nous explorons les avancées récentes des outils de diagnostic CRISPR-Cas et leurs applications potentielles dans la détection des hépatites virales. Tout d'abord, nous passons brièvement en revue les cinq principales classifications des virus de l'hépatite et leurs aspects cliniques. Dans les sections suivantes, nous décrivons l'importance et les applications du système CRISPR-Cas pour le diagnostic des maladies infectieuses, en nous concentrant principalement sur différents effecteurs CRISPR-Cas pour la détection de l'hépatite virale. Nous fournirons également une explication détaillée des avantages et des inconvénients des systèmes de diagnostic basés sur CRISPR et présenterons les perspectives de recherche futures.

L'hépatite virale est l'une des causes les plus fréquentes de morbidité et de mortalité humaines, à la fois due à une infection aiguë et à une complication chronique [17, 18]. Bien que les cinq virus de l'hépatite infectent principalement le foie, ils sont classés en différentes familles virales et sont complètement différents les uns des autres en termes de structure, de génome et de cycle de vie [19]. Le VHA et le VHE se transmettent généralement d'une personne à l'autre par la voie fécale-orale, tandis que le VHB, le VHC et le VHD se transmettent par exposition au sang et aux liquides organiques d'une personne infectée [19]. L'hépatite virale survient souvent sans aucun symptôme. Cependant, l'hépatite chronique peut évoluer vers la jaunisse, l'anorexie, la fibrose et éventuellement la cirrhose et le cancer du foie. Les personnes atteintes d'hépatite présentent initialement des symptômes pseudo-grippaux, similaires à de nombreuses autres infections virales aiguës. Les autres symptômes possibles sont la fatigue, la fièvre, les douleurs articulaires et musculaires, la jaunisse (jaunissement des yeux et de la peau) ainsi que des douleurs abdominales. Dans la plupart des cas, la réponse immunitaire de l'hôte est capable d'éliminer le virus. Cependant, ce taux varie de 100 % de clairance dans les cas de VHA à seulement 20 à 30 % de clairance dans les cas aigus de VHC. Lorsque les infections par le VHB et le VHC persistent jusqu'à 6 mois, elles peuvent être définies comme des hépatites chroniques B et C, respectivement. Chaque hépatite virale est diagnostiquée par une histoire du patient, un examen physique, des tests de la fonction hépatique, des tests sérologiques d'anticorps et un test basé sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour l'acide nucléique viral (ARN ou ADN). Les humains sont les seuls hôtes connus des virus de l'hépatite, à l'exception du VHE, qui peut avoir un réservoir chez les animaux domestiques [20].

Le VHA a été identifié pour la première fois en 1973. Il s'agit d'un virus à ARN monocaténaire non enveloppé, icosaédrique, appartenant à la famille des picornavirus. À l'heure actuelle, le VHA peut être divisé en trois génotypes, dont I, II, III, avec deux sous-types comprenant les sous-types A et B, qui peuvent infecter les humains. Il est généralement transmis par voie fécale-orale, soit par contact de personne à personne et en mangeant ou en buvant des aliments ou de l'eau contaminés. Le VHA est endémique dans de nombreux pays, en particulier ceux dont les ressources en soins de santé sont limitées [21]. La prévalence de l'infection par le VHA est faible dans les pays développés. La séroprévalence des anticorps anti-VHA aux États-Unis est d'environ 10 % chez les enfants et de 37 % chez les adultes. Plus de 50% des cas dans les pays développés sont le résultat d'une infection lors de voyages dans des pays endémiques [22]. Le VHA peut provoquer une infection aiguë qui se résorbe généralement d'elle-même et n'entraîne pas d'infection chronique ni de maladie hépatique chronique. La période d'incubation du VHA se situe entre 15 et 50 jours (28 jours) à partir de l'exposition. Les personnes atteintes de maladies chroniques sous-jacentes courent un risque plus élevé de développer une insuffisance hépatique aiguë due à une infection par le VHA. Le taux de létalité est estimé de 0,3 à 0,6 % pour tous les âges et il augmente à 1,8 % chez les patients de plus de 49 ans [23]. La propagation du VHA dans le foie se produit par la veine porte (le vaisseau sanguin qui amène le sang au foie depuis les intestins) après que le virus a traversé la muqueuse de la paroi de l'intestin grêle. Les virus se répliquent ensuite dans les hépatocytes avant l'excrétion, toujours via la bile via les fèces [24]. L'hépatite A aiguë est principalement diagnostiquée par la présence d'anticorps anti-VHA (IgM anti-VHA). Les IgM anti-VHA deviennent détectables quelques jours avant ou en même temps que l'apparition des symptômes. Les niveaux d'IgM sériques augmentent pendant l'infection aiguë et restent positifs pendant une moyenne de 4 mois après le début des symptômes. Les IgG anti-VHA apparaissent tôt au cours de l'infection et sont détectables pendant de nombreuses années, conférant une immunité à vie. Bien que les techniques d'amplification des acides nucléiques (TAAN, comme la PCR) soient plus sensibles que le test immunologique pour la détection du VHA, elles sont rarement utilisées à cette fin. Le séquençage et l'analyse phylogénétique sont principalement utilisés pour retracer les épidémies, et ces techniques sont particulièrement utiles pour identifier les voies de transmission [24, 25]. Les vaccins actuellement disponibles contre le VHA sont sûrs et très efficaces et sont inclus dans les programmes de vaccination systématique des enfants dans différents pays [26]. Le schéma de vaccination standard du vaccin inactivé contre le VHA consiste en deux doses administrées à au moins 6 mois d'intervalle. Ce schéma de vaccination s'est avéré hautement protecteur et devrait durer de nombreuses années [27].

Le VHB est un membre prototype de la famille des Hepadnaviridae. C'est un virus enveloppé qui contient de l'ADN double brin détendu, circulaire et partiel [28]. Bien que le VHB soit un virus à ADN, la réplication se produit par transcription inverse à partir d'ARN pré-génomique (ARNpg) [29]. Actuellement, le VHB est classé en 10 génotypes, y compris les génotypes A à J, en fonction des différences dans la séquence du génome, avec 35 sous-génotypes. La distribution des génotypes varie considérablement dans le monde [30]. Le VHB est l'une des causes courantes des maladies du foie, y compris le cancer du foie, et il est très contagieux ; il se transmet par exposition à du sang infecté et à d'autres fluides corporels (en particulier le liquide amniotique, le sperme et les sécrétions vaginales) [31, 32]. Il est 100 fois plus infectieux que le VIH et 10 fois plus que le VHC également [22]. La prévalence de l'infection par le VHB varie selon les régions du monde, allant de 0,7 % de la population adulte dans les zones à faible endémie telles que l'Amérique du Nord, l'Europe occidentale et certaines parties de l'Amérique du Sud à 6,2 % dans les zones à forte endémie telles que l'Afrique. , Asie du Sud-Est et Chine [30]. La prévalence globale du VHB chronique aux États-Unis était d'environ 3/5 % [33]. L'infection par le VHB peut entraîner une maladie aiguë (à court terme) et chronique (à long terme). L'infection aiguë par le VHB peut être asymptomatique ou symptomatique. La plupart des adultes infectés se rétablissent, même si leurs signes et symptômes sont graves, mais 5 à 10 % des adultes infectés développent une infection chronique, pouvant entraîner une cirrhose et un cancer du foie [34]. Le VHB a un tropisme spécifique pour les cellules hépatiques auxquelles il adhère et fusionne lors de la primo-infection. Le VHB est internalisé dans les hépatocytes par endocytose après liaison à son récepteur de haute affinité, le polypeptide co-transporteur du taurocholate de sodium (NTCP). La capside du virus est ensuite libérée dans le cytoplasme et transloquée vers le pore nucléaire via le réseau de microtubules. Au niveau du pore nucléaire, l'ADNc est libéré dans le noyau où il est converti en ADN circulaire fermé par covalence (cccDNA). Dans cette étape, l'ADNccc devient chromatinisé et sert de matrice de transcription pour tous les ARN prégénomiques du VHB. Dans le cytoplasme, le pgRNA est encapsidé et rétrotranscrit en rcDNA. Les capsides sont soit enveloppées et sécrétées sous forme de nouveaux virions par la cellule, soit transportées vers le noyau pour amplifier le pool d'ADNccc [35]. L'ADN du VHB codé par plusieurs protéines différentes joue un rôle essentiel dans la persistance virale et la pathogenèse du foie, y compris deux protéines centrales, un antigène central particulaire (HBcAg) et un antigène sécrété (HBeAg), un antigène de surface (HBsAg), HBx et une polymérase et tous qui jouent un rôle dans son diagnostic et sa surveillance [24, 36]. Après l'infection, l'ADN du VHB et l'HBsAg peuvent être détectables dans le sérum d'une personne infectée en 1 à 2 semaines. Six à huit semaines plus tard, les IgM anti-HBc et HBeAg deviennent détectables. Dans les cas d'infection aiguë par le VHB, l'HBsAg et l'HBeAg disparaissent en 4 à 6 mois. La disparition de HBsAg est suivie par l'apparition d'Anticorps contre HBsAg (Anti-HBs). L'intervalle entre la disparition de l'AgHBs du sérum et l'apparition des anti-HBs dans celui-ci est appelé phase fenêtre et peut durer jusqu'à 6 mois [22]. Par conséquent, l'étape initiale du diagnostic du VHB est réalisée à l'aide d'un test sérologique pour détecter l'HBsAg et d'autres antigènes et anticorps du VHB. D'autres tests moléculaires de détection quantitative et qualitative sont utilisés pour vérifier la première étape du diagnostic (tableau 1) [37]. La réactivation du VHB fait référence à une augmentation soudaine de la réplication du VHB chez un patient atteint de VHB chronique ou antérieur. Bien que la réactivation du VHB (VHBr) puisse se produire spontanément, elle est plus souvent induite par le traitement médicamenteux immunosuppresseur (ISDT) pour le cancer, les maladies immunologiques ou la transplantation [38]. La vaccination est une stratégie très efficace pour la prévention de l'infection par le VHB. Une série de trois doses de vaccins contre l'hépatite B (recombinant), composés d'HBsAg, entraîne un niveau protecteur de titres d'anti-HBs chez > 90 % des individus en bonne santé [39].

Le VHC, membre de la famille des Flaviviridae, possède un génome d'ARN simple brin de sens positif codant trois protéines structurelles et sept protéines non structurelles. Le taux de mutation élevé du VHC conduit à une hétérogénéité génomique marquée. Le VHC est classé en sept génotypes confirmés et au moins 67 sous-types confirmés. Pendant ce temps, les génotypes 1 à 3 sont distribués à l'échelle mondiale, tandis que les génotypes 4 à 6 sont concentrés dans une certaine zone. Le génotype 4 et le sous-type 5a du VHC sont endémiques au Moyen-Orient et dans le nord de l'Afrique du Sud, respectivement. Les génotypes 6 et 7 du VHC sont principalement observés en Asie du Sud-Est et en République démocratique du Congo, respectivement [24, 40]. Les principales formes de transmission du VHC se font par voie sanguine, comme l'utilisation de drogues par voie intraveineuse et intranasale, la contamination des injections de médicaments et les contacts sexuels [41]. La prévalence mondiale du VHC est estimée entre 1,5 et 2,3 % dans les zones les plus touchées et entre 0,5 et 1,0 % dans les autres [42]. La prévalence du VHC chez les utilisateurs de drogues injectables se situe entre 50 et 90 %, ce qui constitue le groupe le plus important parmi les personnes infectées [43]. Le VHC peut provoquer des infections aiguës avec une forte tendance aux maladies chroniques. Le VHC chronique peut entraîner une maladie hépatique grave, y compris la cirrhose et le risque de CHC [44]. Les récepteurs scavenger de classe B de type I (SCARB1), Occluding (OCLN), Claudin-I (CLDN1) et Cluster of differentiation 81 (CD81) sont les principaux facteurs hôtes qui facilitent la fixation et l'absorption du VHC dans les hépatocytes. De plus, CD81 interagit avec la particule virale par l'intermédiaire de la glycoprotéine d'enveloppe virale E2 ou d'autres molécules, facilitant l'entrée de la particule virale dans l'hépatocyte [45]. Le diagnostic virologique du VHC est établi par deux catégories de tests de laboratoire, dont les tests indirects, dans lesquels des dosages sérologiques sont effectués pour détecter un anticorps spécifique du VHC (anti-VHC) chez le patient infecté, et les tests directs, dans lesquels la détection, la quantification , ou la caractérisation des composants des particules virales du VHC telles que l'ARN du VHC et l'antigène central peut être effectuée. La sensibilité et la spécificité des immunodosages enzymatiques (EIA) de troisième génération pour la détection des anticorps dirigés contre différents antigènes de la particule virale du VHC est de 99 % après 2 à 6 mois suivant l'exposition au virus. L'une des méthodes de dosage direct est l'utilisation de la PCR en temps réel pour la détection quantitative ou qualitative de l'ARN du VHC, qui peut détecter les particules de VHC chez les patients avec au moins 10 à 15 UI/mL (Tableau 2) [46].

Le HDV, membre du genre Deltavirus, est un virus à ARN enveloppé, circulaire, simple brin à sens négatif qui code pour deux types de protéines ; la petite protéine (S-HDAg) et la grande protéine (L-HDAg), qui ont respectivement une taille de 24 kDa et 27 kDa. Le S-HDAg est nécessaire à la réplication de l'ARN viral, tandis que le L-HDAg est essentiel à l'assemblage viral [47]. Le HDV est considéré comme un virus satellite car il nécessite l'assistance des protéines de surface du VHB (HBsAg) pour générer des particules de virion matures. En conséquence, deux modèles distincts d'infection pour le HDV peuvent s'établir ; soit une co-infection VHB/VHD, soit une surinfection VHD. La co-infection VHB/VHD survient lorsqu'une personne est simultanément infectée par le VHB et le VHD, tandis que la surinfection par le VHD survient lorsqu'une personne déjà infectée de manière chronique par le VHB contracte le VHD. Le développement d'une surinfection chronique par le VHD peut exacerber les lésions hépatiques causées par le VHB, et il a été démontré que la co-infection et la surinfection entraînent des résultats plus graves que l'infection par le VHB seule, y compris l'hépatite fulminante, le CHC et l'hépatite chronique [48]. Actuellement, trois génotypes de HDV ont été identifiés (génotype I-III), parmi lesquels le génotype I est prédominant [22]. Comme le VHB et le VHC, le VHD se transmet principalement par voie sexuelle, ainsi que par l'exposition à du sang et à des produits sanguins infectés [28]. À l'échelle mondiale, on estime qu'environ 5 à 10 % des patients atteints d'hépatite B chronique (HCB) sont co-infectés par le VHD, avec une prévalence plus élevée dans les populations d'injection de drogue. Les zones à forte prévalence d'infection par le VHD comprennent le bassin méditerranéen, l'Amérique du Sud, la Mongolie et le Soudan. En Amérique du Nord et en Europe du Nord, la prévalence est faible et principalement confinée aux consommateurs de drogues injectables [22, 49]. La première étape du diagnostic de l'infection par le HDV consiste à tester les individus HBsAg-positifs pour les anticorps totaux spécifiques au HDV (IgG et IgM combinés) dans le sérum. Pour les patients positifs aux anticorps anti-HDV, l'étape suivante consiste à rechercher l'ARN du HDV dans le sérum pour déterminer si l'anticorps représente une infection active par le HDV en cours (ARN-HDV positif) ou représente uniquement une cicatrice sérologique (ARN-HDV négatif) [ 50].

Le VHE a été découvert pour la première fois en 1983 lorsque les scientifiques cherchaient la cause de l'épidémie d'hépatite non A, non B (NANB), qui se transmet par voie entérique [51]. Le VHE appartient au genre Hepevirus de la famille des Hepeviridae. [52, 53]. Trois groupes de mammifères Hepeviridae ont été reconnus sur la base du séquençage complet du génome de souches humaines et animales. La première catégorie comprend les virus qui affectent les humains, les porcs, les cerfs et les lapins. Les 24 sous-génotypes des quatre génotypes humains du VHE (génotypes 1 à 4) identifiés chez les patients infectés sont inclus dans ce groupe [53]. Le VHE est le plus souvent transmis par contamination de l'eau et des aliments, et moins fréquemment par voie zoonotique ou par transfusion sanguine [52]. Les génotypes 1 à 4 du VHE présentent une distribution géographique sélectionnée. Les génotypes 1 et 2 sont les principales causes d'infections aiguës par le VHE dans les zones endémiques d'Asie du Sud et d'Afrique subsaharienne [54]. Le génotype 3 est le génotype le plus courant associé à l'infection par le VHE en Europe et en Amérique [55]. Le génotype 4 du VHE a été initialement identifié uniquement en Asie, mais d'autres rapports ont également identifié ce génotype chez les porcs et les humains en Europe [52]. Les génotypes 1 et 2 du VHE sont des agents pathogènes humains obligatoires et sont principalement transmis par l'eau potable contaminée dans les zones où l'assainissement est médiocre, tandis que les génotypes 3 et 4 sont zoonotiques et principalement transmis par la consommation de viande crue ou insuffisamment cuite ou de produits hépatiques de son hôte principal (c'est-à-dire , cochon, sanglier et cerf) [56]. L'infection par le VHE est généralement spontanément résolutive et provoque une hépatite aiguë. L'infection par le VHE a une période d'incubation de 15 à 60 jours. Le VHE aigu typique peut entraîner une élévation des aminotransférases à plus de 10 fois la normale. Les principaux symptômes cliniques décrits sont l'anorexie, les nausées, les malaises et les douleurs abdominales, auxquels s'ajoutent les arthralgies, la diarrhée, le prurit et une éruption cutanée. Dans les 1 à 6 semaines suivant les infections, les aminotransférases reviennent à la normale. Le taux de létalité est d'environ 0,5 à 3 % chez les adultes. Le VHE peut également provoquer une insuffisance hépatique fulminante (FHF), dans laquelle une encéphalopathie se développe dans les jours ou les semaines suivant l'apparition des symptômes. La FHF semble survenir plus fréquemment chez les femmes enceintes, d'où un taux de létalité plus élevé pour le VHE chez les femmes enceintes [22]. Des tests sérologiques et des tests basés sur les acides nucléiques ont été développés pour le diagnostic du VHE à des fins épidémiologiques et diagnostiques. Le dosage sérologique de l'infection par le VHE dépend généralement de la détection des IgG anti-VHE et des IgM anti-VHE. Les anticorps IgM anti-VHE sont généralement détectables dans la phase aiguë de la maladie et leur présence dans le sérum dure environ 4 ou 5 mois, indiquant une exposition récente, tandis que les anticorps IgG anti-VHE peuvent persister plus de 10 ans, indiquant une exposition antérieure. Par conséquent, le diagnostic d'infection aiguë par le VHE repose sur la présence d'IgM anti-VHE, tandis que le test de diagnostic des IgG anti-VHE est une bonne option pour les enquêtes épidémiologiques [57]. Cependant, la détection et la quantification de l'ARN-VHE par PCR est une approche de référence pour le diagnostic de l'infection aiguë et chronique par le VHE [58]. Actuellement, aucun vaccin spécifique, à l'exception de celui autorisé en Chine, ni aucune option thérapeutique ne sont disponibles pour le VHE [22].

En tant qu'agents infectieux de potentiellement tous les types de cellules vivantes, les virus sont les entités biologiques les plus abondantes dans l'environnement, qui peuvent provoquer une épidémie qui menace la vie et la santé des humains et des animaux et entraîner des pertes économiques importantes. La survenue d'une épidémie grave entraîne souvent des pertes ou des dommages irréversibles, de sorte qu'une diagnostic précoce et rapide du virus infectieux est particulièrement important [59]. Les techniques traditionnelles de diagnostic en laboratoire des infections virales peuvent généralement être divisées en 3 catégories, notamment (1) la détection directe des virions dans le matériel du patient, les antigènes viraux ou les acides nucléiques viraux, (2) l'isolement du virus dans des cellules en culture, suivi de l'identification de l'isolat (examen indirect) et (3) diagnostic sérologique qui sont basés sur la détection et la mesure des anticorps dans le sérum du patient [60]. Le meilleur outil de diagnostic viral doit répondre aux critères d'exigence suivants : rapidité, simplicité, sensibilité, spécificité et coût. Test d'amplification des acides nucléiques (NAAT), y compris la PCR, la PCR en temps réel, la RT-PCR, l'amplification basée sur la séquence d'acide nucléique (NASBA) et l'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), et les méthodes basées sur la détection du complexe anticorps-antigène telles que comme les immunoessais enzymatiques en phase solide (EIA) et la technologie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), en particulier, ont révolutionné la virologie diagnostique et sont maintenant largement utilisés pour détecter différents virus [61, 62]. Actuellement, les TAAN sont décrits comme une méthode « Gold Standard » pour le diagnostic des infections virales en raison de sa sensibilité et de sa spécificité élevées. Cependant, les techniques de dignose virale basées sur la PCR sont limitées par le coût élevé des réactifs et des instruments, ainsi que par la lourdeur technique de fonctionnement. La méthode analytique de nouvelle génération basée sur le clivage non spécifique de l'ADN et de l'ARN observé dans les systèmes CRISPR-Cas offre des avancées prometteuses dans le diagnostic basé sur CRISPR des maladies infectieuses émergentes en raison de sa haute spécificité, de sa polyvalence et de son cycle de détection rapide [62, 63].

Les principales découvertes selon lesquelles les cellules procaryotes comme les bactéries et les archées ont une immunité adaptative héréditaire contre les éléments génétiques étrangers médiés par les protéines CRISPR et associées à CRISPR (Cas) ont conduit à des avancées transformatrices en biologie moléculaire [64]. Les cellules procaryotes stockent ces éléments génétiques provenant d'agents infectieux tels que les bactériophages, les plasmides ou les transposons dans un locus génomique appelé réseaux CRISPR, permettant à la cellule de se souvenir, de reconnaître et d'éliminer les infections. Les protéines cas facilitent l'immunité adaptative grâce au processus en plusieurs étapes qui comprend l'adaptation, la biogenèse de l'ARN CRISPR (ARNcr) et l'interférence. Au cours de l'adaptation qui est la première étape de l'immunité CRISPR, les éléments génétiques étrangers sont reconnus, traités et sélectionnés pour être intégrés dans le réseau CRISPR, fournissant un élément de rappel lors d'une infection récurrente. Au cours de l'étape d'expression, également connue sous le nom de biogenèse du crRNA, le réseau CRISPR est transcrit en un long précurseur (pré-crRNA) et transformé en forme mature en tant que crRNA. Dans la dernière étape, les crARN matures guident les protéines Cas pour cliver des séquences complémentaires d'ADN étranger (interférence) et éliminer ces éléments. En découvrant les composants structuraux et fonctionnels de ces divers systèmes, de nouveaux outils, dont ceux applicables au diagnostic moléculaire, émergent [65].

Depuis la découverte initiale des systèmes CRISPR-Cas, ses différentes variantes se sont rapidement développées. Actuellement, les systèmes CRISPR-Cas sont divisés en deux classes, six types et plusieurs sous-types basés sur des relations évolutives. Selon la nature des complexes ribonucléoprotéiques effecteurs, deux classes principales de systèmes CRISPR-Cas ont été définies ; Classe 1 (comprend les types I, III et IV) et Classe 2 (comprend les types II, V et VI). Les systèmes de classe 1 sont caractérisés par un complexe de plusieurs protéines effectrices, et les systèmes de classe 2 englobent une seule protéine de liaison à l'ARNc [11]. La plupart des systèmes CRISPR-Cas identifiés (environ 90 %) appartiennent aux systèmes de classe 1 [16]. Parmi les divers systèmes CRISPR, les systèmes de classe 2 ont principalement été appliqués pour le diagnostic, car ces systèmes sont plus simples à reconstituer. Ils comprennent des enzymes à activité collatérale, qui servent de colonne vertébrale à de nombreux tests de diagnostic basés sur CRISPR. Cas9, Cas12 et Cas13 ont un impact majeur sur la classification CRISPR-Cas pour le type II, le type V et le type VI en tant que nucléases effectrices à signature unique, respectivement. La dernière classification des systèmes CRISPR-Cas attribue le plus grand nombre de sous-groupes au système de type V avec 17 sous-groupes dérivés [11]. Des systèmes de classe 1 (tels que la nucléase effectrice de type III Csm6 ou Cas10) ont également été conçus pour le diagnostic, soit en combinaison avec des composants du système de classe 2, soit avec le complexe natif de type III) [66]. Un domaine de nucléase de type RuvC dans le système Cas12 catalyse le clivage d'une cible d'ADNdb par des systèmes de type V [67]. Cette caractéristique a conduit à l'utilisation de Cas12a, également connu sous le nom de Cpf1, dans les tests de diagnostic de pathogènes viraux [68, 69]. Le système CRISPR-Cas de type VI comporte cinq variantes de sous-type. Cas13a dans le sous-type VI-A est connue sous le nom de Rnase guidée par l'ARN [16]. Cas13a est capable de se lier à l'ARNc et de former ainsi un complexe qui finit par cliver l'ARNss [12]. La capacité de Cas13a dans les clivages d'ARNss a conduit au développement de plates-formes modernes pour la détection rapide et sensible des maladies infectieuses. Chacune des plateformes de diagnostic d'infection virale basées sur Cas12a et Cas13a est discutée dans la section suivante (Fig. 1) [70, 71].

Classification des classes de systèmes CRISPR-Cas en fonction de leurs protéines effectrices

En raison de la nature programmable des systèmes CRISPR-Cas, ils ont été exploités dans de nombreux domaines différents de la biologie et de la médecine et, en fait, ont révolutionné ces domaines. Un nombre croissant d'études ont montré que la technologie CRISPR/Cas peut être intégrée à des biocapteurs et à des essais biologiques pour le diagnostic moléculaire. Les diagnostics basés sur CRISPR ont attiré beaucoup d'attention en tant que capteurs hautement spécifiques et sensibles avec des capacités facilement programmables et indépendantes de l'appareil. Cette technique a été utilisée pour la détection de biomarqueurs à base d'acide nucléique de maladies infectieuses et non infectieuses et pour la détection de mutations et de délétions indicatives de maladies génétiques. Avec d'autres recherches, il est prometteur pour détecter d'autres biomarqueurs tels que les petites molécules et les protéines [66, 72]. Dans cette section, nous décrivons brièvement l'application des systèmes CRISPR/Cas dans le domaine du diagnostic.

L'objectif principal des approches de diagnostic basées sur CRISPR est l'identification d'agents pathogènes spécifiques, tels que les virus à ADN ou à ARN, les bactéries et les parasites. Les virus à ARN détectés avec l'approche basée sur CRISPR comprennent le parvovirus B19, le virus Zika (ZIKV), le virus de la dengue (DENV), le virus de l'encéphalite japonaise, le virus Ebola (EBOV) et le virus Corona. Outre les virus à ARN, des virus à ADN tels que le cytomégalovirus (CMV), le virus d'Epstein-Barr, le virus BK (BKV) et le virus du papillome humain (VPH) ont également été détectés avec des diagnostics basés sur CRISPR [73]. Le système CRISPR/Cas a également été utilisé pour la détection de diverses bactéries pathogènes telles que Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella enteritidis [74]. De plus, la technique de CRISPR/Cas a été appliquée avec succès pour la détection ultrasensible du parasite Plasmodium responsable du paludisme [75].

Des technologies de diagnostic basées sur CRISPR-Cas ont également été mises en œuvre pour la détection de matériel génétique pertinent pour les maladies non infectieuses. Par exemple, ce système a été utilisé pour détecter des niveaux anormaux d'ARNm CXCL9 humain, un indicateur de rejet aigu de greffe de rein cellulaire, afin de détecter la maladie du greffon contre l'hôte dans les greffes de rein [76]. Outre les ARNm, le système de diagnostic basé sur CRISPR a également été utilisé pour détecter des miARN spécifiques tels que miR-19b dans le sérum de patients atteints de médulloblastome [77] et miR-17 isolé à partir de lignées cellulaires de cancer du sein [78].

L'un des points forts des diagnostics basés sur CRISPR est la spécificité mononucléotidique des enzymes Cas, qui permet la discrimination des mutations ponctuelles (SNP) et des petites délétions. La spécificité mononucléotidique de la détection basée sur CRISPR a permis à ce système de détecter des marqueurs de résistance aux antimicrobiens, des délétions et des mutations dans le gène du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et BRAF [79], mutations conférant la dystrophie musculaire de Duchenne [80 ] et des SNP dans le gène E3 de l'ubiquitine ligase conférant la couleur des yeux. Le potentiel de spécificité du système CRISPR-Cas a également été exploité pour la détection des miARN, qui sont difficiles à diagnostiquer en raison de leur petite taille et parce qu'ils ne peuvent différer que d'une seule base [66].

Un diagnostic précis, sensible et rapide des infections virales est la première étape essentielle vers un traitement précis et rapide des infections virales. Le diagnostic des agents pathogènes basé sur CRISPR-Cas a gagné en popularité au cours des dernières années, principalement en raison de la haute spécificité, de la sensibilité et du diagnostic rapide de ce système [81]. De nombreuses variantes et avancées ont été introduites dans la plate-forme basée sur CRISPR, en comptant sur l'activité collatérale des protéines CRISPR-Cas de type V et de type VI, mais la conception générale reste inchangée. Dans ce qui suit, nous avons décrit les différentes plates-formes basées sur les nucléases associées à CRISPR Cas9, Cas12 ou Cas13 utilisées pour le diagnostic de différentes infections virales.

En 2016, Pardee et al. introduit la première méthode de diagnostic basée sur CRISPR/Cas capable de reconnaître l'ADNdb. Ils ont développé une méthode de diagnostic rapide et peu coûteuse pour détecter le virus Zika à l'aide de CRISPR de type II, appelée amplification basée sur la séquence d'acide nucléique et clivage CRISPR (NASBACC). Le système NASBACC se compose de trois parties : l'amplification basée sur la séquence d'acide nucléique pour la préamplification isotherme des cibles, la reconnaissance de l'ADN cible dépendante du motif adjacent au protospacer (PAM) par le Cas9 et un détecteur de pied pour la lecture. En bref, un interrupteur déclenché se lie à un fragment d'ARN amplifié par NASBA via une transcription inverse. Si la séquence PAM est disponible dans le fragment d'ARN, le clivage médié par Cas9 provoque un ARN court sans la séquence de déclenchement. En l'absence de la séquence PAM, le déclencheur contenant l'ARN de pleine longueur active l'interrupteur du pied, indiqué par un changement de couleur [82]. Cependant, la même année où l'activité de clivage collatéral de Cas13a a été découverte, ce domaine a été révolutionné. L'activité collatérale exige le clivage d'ARN simple brin non ciblé (ssRNA; Cas13) et d'ADN simple brin (ssDNA; Cas12) dans une solution, permettant la détection d'acides nucléiques par amplification du signal et permettant des lectures multiples grâce à l'ajout de fonctionnalisé acides nucléiques rapporteurs. Dans des études récentes, diverses méthodes basées sur CRISPR, telles que DNA Endonucléase-Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) et Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK), ont été développées et utilisent des enzymes de type V CRISPR-CAS12a et de type VI Cas13a. , respectivement. Le système SHERLOCK utilise l'endonucléase Cas13 pour dégrader les brins d'ARN et le système DETECTR utilise la protéine Cas12a pour faire de même sur l'ADN [16, 68].

La première plateforme applicable basée sur le système CRISPR-Cas type VI (Cas13), SHERLOCK, a été développée en 2017 par le Zhang Lab sur la base de l'activité de la nucléase Cas13 de Leptotrichia wadei [16]. Le système SHERLOCK CRISPR-Cas fait référence à une nouvelle détection d'acide nucléique utilisant des nucléases Cas13 ou Cas12 associées à une étape de préamplification isotherme pour augmenter la quantité d'ADN ou d'ARN présentant des niveaux élevés d'activité RNase collatérale lors de la reconnaissance d'une séquence cible spécifique. Le système SHERLOCK se compose de trois étapes de base : (1) La première étape est la préamplification isotherme, qui génère plusieurs copies d'une matrice d'ARN ou d'ADN à l'aide d'amorces spécifiques. (2) Ensuite, l'amorce directe contenant un promoteur T7 est intégrée dans les amplicons lors de la réaction RPA. Le promoteur T7 permet à la transcription de l'ARN T7 de l'ADNdb de le convertir en amplicons d'ARNss pour fournir des cibles pour le Cas13a du complexe Leptotrichia wadeii (LwaCas13-ARNcr). La reconnaissance et l'appariement de bases entre l'ARNc et la séquence cible activent l'activité collatérale de LwaCas13a, entraînant une dégradation non spécifique de la séquence des rapporteurs d'ARN éteints adjacents et (3) dans la dernière étape, la détection d'acide nucléique basée sur la fluorescence avec LwaCas13a est réalisée en incorporant une fluorescence sonde qui émet un signal détectable. Les molécules rapporteurs d'ARNsb sont composées d'un fluorophore et d'un extincteur, qui sont reliés l'un à l'autre par un oligomère d'ARN court, qui, après séparation, permet la séparation du fluorophore de l'extincteur et, par conséquent, émet un signal de fluorescence qui détermine la présence des virus à ARN (Fig. 2). Le système SHERLOCK est très sensible et est capable de détecter une attomolaire (aM ou 10–18 M) de la cible [66, 83].

Méthodes SHERLOCK dans la détection des acides nucléiques basées sur la technologie CRISPR

Récemment, une deuxième version du système SHERLOCK appelée SHERLOCKv2 a été développée, qui prend environ 2 h à compléter et augmente également la sensibilité de détection à deux attomolaires [79]. Dans cette plate-forme, la protéine Cas est ajoutée à l'échantillon avec le crRNA (conçu pour se lier spécifiquement à la séquence cible) et les sondes ssDNA (en tant que rapporteurs). Les sondes sont liées à un fluorophore à une extrémité et à un extincteur à l'autre extrémité, et s'il y a une séquence cible dans l'échantillon, le crARN se lie à cette séquence et l'activité collatérale de Cas13a sera activée et clive les sondes. En conséquence, des fluorophores sont libérés et un signal fluorescent stable et fort est détecté par un fluorimètre [84]. La supériorité de SHERLOCKv2 sur SHERLOCK est importante dans la mesure où la totalité de la réaction SHERLOCKv2 est réalisée en une seule étape en ajoutant l'échantillon directement sur la bandelette réactive. De plus, aucune purification et séparation des acides nucléiques n'est requise sur les échantillons [85]. Diverses plateformes basées sur la protéine Cas13 ont évolué. Myhrvold et al. développé HUDSON (chauffage d'échantillons de diagnostic non extraits pour effacer les nucléases) et l'a combiné avec SHERLOCK. Grâce à cette combinaison, ils ont pu détecter directement les virus de la dengue et du Zika dans les fluides corporels des patients à de très faibles concentrations (1 copie par microlitre). L'avantage de cette plate-forme est qu'il n'y a pas besoin de prétraitement des échantillons [86].

Cas12a est une autre enzyme Cas avec une activité collatérale qui détecte les molécules d'ADN. L'une des premières plateformes de détection basée sur Cas12a développée en 2018 par Doudna et al. était DETECTR [86]. Dans ce système, la protéine Cas12a de la bactérie Lachnospiraceae (LbCas12a) avec une activité collatérale non spécifique est guidée vers des cibles d'ADNdb par un ARNc complémentaire, déclenchant le clivage collatéral de courts reporters d'ADNss portant un fluorophore et un extincteur. Semblable à SHERLOCK, la reconnaissance de la cible et le clivage du rapporteur conduisent à la séparation du fluorophore du quencher, qui émet un signal de fluorescence (Fig. 3) [87]. Cas12a a une activité collatérale relativement faible. Par conséquent, les méthodes de diagnostic basées sur Cas12 ont une faible sensibilité pour la détection des acides nucléiques. Avec l'incorruption de la préamplification isotherme par RPA, DETECTR a atteint une sensibilité attomolaire pour la détection de l'ADN, ce qui lui permet de détecter de faibles concentrations cibles (concentrations de 2 aM) [88]. Dans d'autres techniques basées sur Cas12, Li et al. ont utilisé l'activité collatérale de cette enzyme et ont développé une plateforme de détection appelée HOLMES (a One-Hour Low-cost Multipurpose Highly Efficient System) pour la détection rapide de cibles ADN et ARN. La base de HOLMES est similaire à SHERLOCK en ce qu'en présence d'ADN cible dans l'échantillon, le crRNA (en complexe avec Cas12a) s'y lie, un complexe ternaire (CAS12a-crRNA-ADN cible) se forme et l'activité collatérale de l'enzyme Cas est activée et les sondes sont dégradées [87]. Ce sont les plateformes de détection basées sur CRISPR les plus utilisées pour identifier les agents pathogènes ; cependant, il existe d'autres plates-formes, telles que Cas9 - trouvant des séquences de faible abondance par hybridation (FLASH) et Cas14-DETECTOR, dont l'explication nécessite un autre article de synthèse [89, 90].

Méthodes DETECTR dans la détection des acides nucléiques basées sur la technologie CRISPR

Jusqu'à présent, de nombreux virus à ADN et à ARN ont été diagnostiqués à l'aide de ces méthodes. Le système SHERLOCK basé sur CRISPR-Cas permet la détection du virus Zika, du virus Ebola et du virus de la dengue avec une sensibilité d'environ 1 copie par microlitre d'échantillon. Il a également permis la détection du virus du Nil occidental (WNV), du virus de la fièvre jaune (YFV) et du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2). De même, la technologie DETECTR a également été utilisée pour détecter le SRAS-CoV-2. De plus, les souches de papillomavirus humain (HPV) (HPV-16 et HPV-18) peuvent être diagnostiquées par la technologie DETECTR. Dans la section suivante, l'application potentielle de différents systèmes CRISPR-Cas dans le diagnostic de l'hépatite virale est discutée [91].

Atteindre l'objectif de l'Organisation mondiale de la santé d'éliminer l'hépatite virale d'ici 2030 nécessite un diagnostic précis de la maladie. Comme mentionné, le test de diagnostic idéal doit fournir une identification précise et sensible des virus tout en étant abordable, portable et capable de distinguer différentes variantes. Le développement de nouveaux outils répondant aux exigences du test de diagnostic standard de l'OMS peut complètement remodeler les systèmes de surveillance épidémiologique et de soins médicaux des hépatites virales dans le monde [85]. À cet égard, le système émergent CRISPR/Cas peut offrir une opportunité en tant qu'outil de diagnostic de précision prometteur, en particulier pour l'ADN du VHB et l'ARN du VHC, qui sont les indicateurs les plus importants de l'hépatite virale, en ciblant l'ADN ou l'ARN viral. Dans cette section, nous passons en revue les études menées dans le domaine de la détection des virus de l'hépatite à l'aide de différentes plateformes CRISPR-Cas.

Chen X et al. a conçu une plate-forme de détection basée sur CRISPR-Cas, connue sous le nom de "CRISPRHBV", pour la détection ultrasensible et précoce de deux génotypes majeurs du VHB (VHB-B et VHB-C) dans des applications cliniques. CRISPR-HBV se compose de trois étapes, dont l'amplification par déplacement croisé multiple (MCDA) pour une préamplification rapide, la détection basée sur Cas12b pour décoder les cibles et la lecture des résultats avec des biocapteurs à fluorescence et à flux latéral en temps réel. Ce système est capable de détecter 10 copies d'ADN génomique par test et a une spécificité de 100 % et n'a également aucune réactivité croisée avec d'autres génotypes et agents pathogènes du VHB. L'ensemble du processus de test, qui comprend l'extraction de la matrice d'ADN, la réaction de préamplification MCDA, la détection basée sur CRISPR-Cas12b et la lecture des résultats, peut être effectué en 60 minutes et ne nécessite pas d'équipement coûteux. De plus, la faisabilité du test CRISPR-HBV pour le génotypage du VHB-B et -C a été confirmée avec succès par validation avec des échantillons cliniques. Par conséquent, le système CRISPR-HBV a le potentiel d'être un test de diagnostic POC pour la détection et le diagnostic des génotypes B et C du VHB dans les applications cliniques, en particulier dans les pays disposant de ressources médicales insuffisantes [92].

Étant donné que la formation d'un réservoir intranucléaire d'ADNccc dans l'hépatocyte est la principale cause d'infection persistante par le VHB, Zhang, X et al. développé des outils de diagnostic hautement sensibles et spécifiques pour la détection de l'ADNccc du VHB basés sur la technologie CRISPR-Cas13a. Cette technique comprend les étapes suivantes : (1) utilisation de la DNase dépendante de l'ATP (PSAD) et des enzymes HindIII sans plasmide pour digérer l'ADNc circulaire et l'ADN double brin linéaire, (2) amplification de fragments d'ADNccc spécifiques du VHB à l'aide de l'amplification en cercle roulant (RCA ) et PCR, et (3) détection de cible à l'aide du système CRISPR-Cas13a. Ce test peut détecter 1 copie/µL d'ADNccc du VHB par lecture de fluorescence assistée par CRISPR/Cas13. De plus, en effectuant ddPCR, qPCR, RCA-qPCR, PCR-CRISPR et RCA-PCR-CRISPR, ce test a été validé pour la détection de cccDNA dans les tissus hépatiques associés au VHB, le plasma, le sang total et les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC ) [93].

De nombreuses études ont révélé que les mutations de résistance aux médicaments survenant dans le génome du VHB peuvent augmenter le risque de transmission du VHB ou provoquer une réplication active du génome viral, entraînant une infection lytique et d'autres problèmes cliniques chez les patients affectés. L'un des facteurs les plus importants de la résistance aux médicaments antiviraux est la mutation du motif YMDD du gène P du VHB. Par conséquent, Wang S. et al. a développé une méthode très sensible et pratique pour la détection de l'ADN du VHB et de la mutation de résistance aux médicaments YMDD basée sur le système de détection CRISPR-Cas13a et l'amplification par PCR, et a évalué sa capacité de diagnostic à l'aide d'échantillons cliniques. Cette technique représente une sensibilité très élevée pour détecter le VHB et identifier les mutations de résistance aux médicaments à l'aide de la PCR conventionnelle. Étant donné que l'amplification par PCR est plus stable que les techniques d'amplification isotherme, la PCR a été utilisée pour cibler l'amplification avant la détection de CRISPR-Cas13a. En termes de sensibilité, il a été constaté que cette technique peut détecter une copie par test pour l'ADN du VHB et les mutations de résistance aux médicaments YMDD [94]. Dans une autre étude, Ding, R et al. a développé un test POC VHB rapide et sensible basé sur le CRISPR-Cas12a couplé à la LAMP. Ce test résout de manière créative le problème de la technique POC en 10 min, en particulier le problème d'extraction d'échantillon d'acide nucléique. Sur la base de l'amplification isotherme en boucle (LAMP)-Cas12a, la visualisation des résultats du test est fournie avec les bandelettes de test à flux fluorescent et latéral. Une détection en temps réel à haute sensibilité peut être obtenue en lecture de fluorescence, tandis que des résultats visibles à l'œil nu peuvent être obtenus avec la technologie des bandelettes réactives à flux latéral. Le test Cas12a basé sur la lecture fluorescente peut réaliser une détection du VHB avec une sensibilité de 1 copie/µL en 13 min, tandis que la technique de la bandelette réactive à flux latéral ne prend que 20 min. L'évaluation des échantillons cliniques montre la sensibilité et la spécificité de la méthode de lecture de fluorescence et de la bandelette de test à flux latéral à 100 %. De plus, les résultats du test étaient complètement comparables à la qPCR. La technique VHB basée sur LAMP-Cas12a repose sur un équipement minimal et de faibles coûts pour fournir des résultats de test rapides et précis, offrant ainsi un potentiel pratique significatif pour la détection POC du VHB dans les régions médicalement mal desservies (Tableau 3) [95].

La diversité génétique du VHC et des quasi-espèces générées lors de la réplication a conduit à une résistance virale aux antiviraux à action directe (AAD), ainsi qu'à des obstacles au développement d'un vaccin. Le diagnostic précis et rapide de la maladie est une condition préalable à une intervention thérapeutique efficace et à une surveillance épidémiologique [96]. Bien que des techniques telles que l'immunodosage et la qPCR jouent un rôle important dans le diagnostic du VHC, des tests POC rapides et précis sont importants pour identifier les personnes atteintes du VHC, en particulier dans les milieux à ressources limitées où l'accès ou la disponibilité des tests moléculaires sont encore limités. Par conséquent, pour combler cette lacune, il est nécessaire de développer un nouveau test moléculaire pour la détection rapide de l'ARN du VHC dans les milieux à ressources limitées [97]. Récemment, Kham-Kjing et al. développé et évalué une méthode rapide et sensible pour la détection de l'ARN du VHC. La méthode était basée sur un système CRISPR-Cas12 couplé à une amplification isotherme médiée par une boucle de transcription inverse (RT-LAMP) qui permet la détection de séquences spécifiques du génome du VHC. Les produits amplifiés après les réactions de clivage peuvent être visualisés sur des bandes de flux latéral ou mesurés avec un détecteur à fluorescence. Lorsqu'il a été testé sur des échantillons cliniques provenant de personnes infectées par le VHC, le VIH ou le VHB, ou de donneurs sains, le test CRISPR-Cas12 combiné à la RT-LAMP par rapport à la méthode de référence, qui était le test Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, a montré 96 % de sensibilité, 100 % de spécificité et 97 % de concordance. Ce test a pu détecter des concentrations d'ARN du VHC aussi faibles que 10 ng/µL. Par conséquent, cette technique précise et spécifique a le potentiel d'être un test POC rentable et fiable pour identifier les personnes atteintes du VHC dans les milieux à faibles ressources (tableau 3) [98].

Ces études globales ont prouvé le potentiel du système CRISPR/Cas en tant qu'outil de diagnostic efficace pour les hépatites virales. Au-delà de ces études décrites ci-dessus, jusqu'à présent, aucune méthode de diagnostic basée sur CRISPR n'a été développée pour la détection du VHA, du VHD et du VHE. Cependant, l'enzyme Cas12a est l'enzyme de choix pour développer une méthode basée sur CRISPR pour la détection du VHA. De plus, puisque le HDV est un virus à ARN, Cas13a est l'enzyme de choix pour la méthode de diagnostic basée sur CRISPR pour le HDV. Comme le VHD, le VHE est un virus à ARN, Cas13a est donc l'enzyme de choix pour la méthode de diagnostic basée sur CRISPR pour la détection de ce virus. Incertitude, le potentiel du système CRISPR/Cas pourrait bientôt devenir le principal outil de diagnostic pour différentes hépatites virales.

En quelques années, le système de diagnostic moléculaire basé sur CRISPR a été développé à partir d'un outil expérimental pour la biodétection des acides nucléiques en un test de diagnostic cliniquement viable pour la détection rapide, abordable, sensible et spécifique d'agents pathogènes, y compris les virus au POC. Bien que cette technologie présente de nombreux avantages, elle présente plusieurs défis et limitations qui doivent être surmontés pour une application clinique sûre et efficace. Les principales limites de la plupart des outils de diagnostic actuels basés sur CRISPR-Cas, y compris SHERLOCK et DETECTR, sont leur dépendance à la préamplification des acides nucléiques cibles par PCR ou par des processus d'amplification isotherme (par exemple, PCR, RPA ou LAMP). Cependant, le processus d'amplification isotherme nécessite souvent un ensemble de protéines telles que ; polymérase, recombinase ou protéines de liaison et amorces qui comprend 2 amorces pour RPA et 4 à 6 amorces pour LAMP et des étapes supplémentaires de préparation des échantillons, ce qui complique considérablement et allonge le temps de dosage de 20 min à 2 h [99]. Pour résoudre ces problèmes, diverses méthodes de détection sans amplification telles que le CRISPR numérique, plusieurs crARN et des méthodes de transduction de signal très sensibles ont été développées ces dernières années pour la détection directe d'échantillons non amplifiés, ce qui peut permettre une détection rapide et très sensible des virus. Cependant, ces méthodes nécessitent également des équipements spécifiques tels que des instruments de détection fluorescents ou optiques à coût élevé, des puces microfluidiques, etc., ce qui limite leur large application [100]. On peut prévoir que la future plateforme technologique CRISPR/Cas s'appuiera toujours sur le support d'autres technologies. Par exemple, en combinant davantage de techniques de lecture de signal avec des nanomatériaux, des performances analytiques plus simples et plus sensibles pour des applications plus diverses des caractéristiques uniques du système CRISPR/Cas seront obtenues.

De plus, la facilité d'utilisation des diagnostics basés sur CRISPR est améliorée grâce à des réactions optimisées en un seul pot et à une visualisation simple des résultats des tests. Cependant, la préparation des échantillons nécessite toujours une étape séparée et des températures d'incubation supérieures à la température ambiante nécessitent des dispositifs de chauffage. En outre, les concentrations cibles proches de la plus faible concentration d'analyte (LOD) du test rendent difficile la quantification de la lecture avec certitude, en particulier lors de l'utilisation d'un test à flux latéral. Pour une utilisation à domicile ou au point de service (POC), la conception du test doit combiner des protocoles de préparation d'échantillons simples avec des méthodes de détection robustes pour fournir des résultats robustes dans des conditions variables ou difficiles, telles que le stockage à long terme, la formation limitée des utilisateurs et les conditions environnementales difficiles. . Afin d'atteindre cet objectif, l'intégration de la préparation, de la mesure et des rapports d'échantillons dans des unités simples et faciles à utiliser devient réalisable à l'aide de techniques microfluidiques [66]. Les études futures devraient se concentrer sur le développement d'une approche de diagnostic en une étape plus conviviale impliquant la libération d'acide nucléique viral, la préamplification, la détection médiée par CRISPR-Cas et la lecture du signal.

Un autre inconvénient des systèmes CRISPR-Cas, en particulier Cas9, est l'effet «hors cible», dans lequel Cas9 se lie à des sites génomiques non intentionnels pour le clivage. Un tel effet hors cible peut potentiellement conduire à des résultats faussement négatifs ou positifs. Ce problème peut être surmonté avec l'utilisation d'un logiciel bioinformatique pour concevoir un sgRNA approprié [101].

L'automatisation et l'intelligence artificielle peuvent considérablement renforcer l'application des systèmes CRISPR-Cas dans le diagnostic viral. Les systèmes de diagnostic basés sur CRISPR-Cas peuvent être combinés à l'intelligence artificielle (IA) pour fournir un système d'alerte précoce pour une détection rapide, abordable, précise et intelligente d'un agent infectieux. En particulier, des kits de diagnostic conviviaux et portables basés sur CRISPR-Cas sont fournis aux hôpitaux, aux centres de santé, aux communautés ou même aux individus pour la détection rapide et précise d'agents pathogènes spécifiques. La récupération par smartphone du résultat du test est réalisée via une application. Les données provenant de divers endroits peuvent être stockées et traitées dans un système de cloud computing via le service 5G, auquel un personnel restreint peut accéder pour des décisions d'assistance ou publiquement à des fins de recherche. Le système de cloud computing calcule le risque d'infection pour générer un modèle équipé d'IA en mettant à jour les éléments de diagnostic, puis avertit les décideurs et les individus [102,103,104]. Un tel système d'alarme de diagnostic alimenté par l'IA CRISPR-Cas fournit une alerte précoce sur le risque de virus infectieux à proximité et serait très utile pour une réponse rapide et des mesures appropriées pour prévenir la propagation des infections virales.

Les limites et les inconvénients des techniques de diagnostic traditionnelles ouvrent de nouvelles voies pour utiliser des méthodes de diagnostic moléculaire sensibles et efficaces pour le diagnostic rapide des infections virales. Les systèmes basés sur CRISPR de type II (Cas9), V (Cas12) et VI (Cas13) fournissent des outils de diagnostic avancés pour la détection et le contrôle rapides des virus à ADN et à ARN. Le développement de nouvelles plateformes basées sur CRISPR pour le diagnostic moléculaire de l'hépatite virale promet de changer les soins de santé et d'améliorer la gestion épidémiologique de cette maladie infectieuse à l'échelle mondiale. Actuellement, les tests basés sur CRISPR développés doivent être validés par des essais cliniques et la validation des tests doit être surveillée et maintenue après la mise en œuvre clinique pour garantir leur performance. Malgré de nombreux développements réussis dans la plateforme de diagnostic basée sur CRISPR-Cas, il reste encore un long chemin à parcourir entre le laboratoire et l'utilisation pratique ou clinique.

N'est pas applicable.

Virus herpes simplex

Cytomégalovirus

Virus d'Epstein-Barr

virus varicelle-zona

Virus de l'hépatite A

Virus de l'hépatite B

Virus de l'hépatite C

Virus de l'hépatite delta

Virus de l'hépatite E

Carcinome hépatocellulaire

Séquences courtes associées à CRISPR répétées palindromiques regroupées régulièrement espacées

Point de service

Réaction en chaîne par polymérase

Techniques d'amplification des acides nucléiques

ADN double brin

ADN circulaire fermé par covalence

Récepteur charognard classe B type I

Occlusion

Claudin-I

Cluster de différenciation 81

Immunoessais enzymatiques

Hépatite B chronique

Insuffisance hépatique fulminante

Microscopie électronique

PCR quantitative, NASBA : amplification basée sur la séquence d'acides nucléiques

Amplification isotherme médiée par la boucle

Réaction en chaîne de ligase

PCR transcriptase inverse

PCR numérique

Séquençage de nouvelle génération

Amplification basée sur la séquence d'acide nucléique-clivage CRISPR

CRISPR Trans Reporter ciblé sur l'endonucléase d'ADN

Déverrouillage spécifique du reporter enzymatique haute sensibilité

Motif adjacent Protospacer

Système hautement efficace polyvalent à faible coût d'une heure

Trouver des séquences à faible abondance par hybridation

Virus du nil occidental

Virus de la fièvre jaune

Coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2

Papillomavirus humain

Interféron-a

Analogues nucléosidiques

Apolipoprotéine B ARNm éditant un polypeptide catalytique de type 3

ADN circulaire détendu

ARN prégénomique

Amplification de déplacement de croisement multiple

DNase ATP-dépendante sans plasmide

Amplification du cercle roulant

Cellules mononucléaires du sang périphérique

Boucle d'amplification isotherme

Antiviraux à action directe

Site d'entrée interne des ribosomes.

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Cette recherche a été soutenue par l'Institut national de génie génétique et de biotechnologie, Téhéran, Iran.

Cette recherche n'a reçu aucune subvention spécifique d'organismes de financement des secteurs public, commercial ou à but non lucratif.

Département de l'industrie et de l'environnement et de la biotechnologie, Institut national du génie génétique et de la biotechnologie (NIGEB), Téhéran, 1497716316, Iran

Howra Bahrulolum, Fatemeh Nouri Rouzbahani, Saghi Nooraei, Mehdi Mousavi Sameh & Gholamreza Ahmadian

Département de biotechnologie animale, Institut national de génie génétique et de biotechnologie (NIGEB), Téhéran, 1497716316, Iran

Hossein Tarrahimofrad

Centre de recherche en microbiologie appliquée, Institut de biologie des systèmes et des empoisonnements, Université des sciences médicales de Baqiyatallah, Téhéran, 1435916471, Iran

Abbas Hadjizad

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GA a conçu l'étude. HB, HT, FNR, SN et MM rédigent le projet original. HB a rédigé la version finale du manuscrit. HB a préparé des figures et des tableaux. GA et AH étaient responsables de la révision et de l'édition de la version finale. GA et AH ont contribué à l'administration et à la supervision du projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Gholamreza Ahmadian.

N'est pas applicable.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

N'est pas applicable.

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Réimpressions et autorisations

Bahrulolum, H., Tarrahimofrad, H., Rouzbahani, FN et al. Potentiel du système CRISPR/Cas en tant qu'outils émergents dans la détection de l'hépatite virale. Virol J 20, 91 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02048-5

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Reçu : 04 février 2023

Accepté : 23 avril 2023

Publié: 08 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12985-023-02048-5

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