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May 31, 2023

Analyse de l'impact des variants DGAT1 p.M435L et p.K232A sur les pré

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8999 (2023) Citer cet article

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DGAT1 joue un rôle majeur dans le métabolisme des graisses et la synthèse des triacylglycérides. Seuls deux variants de perte de fonction de DGAT1 altérant les caractères de production laitière chez les bovins ont été signalés à ce jour, à savoir p.M435L et p.K232A. Le variant p.M435L est une altération rare et a été associé au saut de l'exon 16, ce qui entraîne une protéine tronquée non fonctionnelle, et l'haplotype contenant p.K232A a été associé à des modifications du taux d'épissage de plusieurs introns DGAT1. En particulier, la causalité directe du variant p.K232A dans la diminution du taux d'épissage de la jonction de l'intron 7 a été validée à l'aide d'un test minigène dans des cellules MAC-T. Comme ces deux variants de DGAT1 se sont révélés épisogènes, nous avons développé un test génétique de pleine longueur (FLGA) pour réanalyser les variants p.M435L et p.K232A dans les cellules HEK293T et MAC-T. L'analyse RT-PCR qualitative des cellules transfectées avec la construction d'expression DGAT1 pleine longueur portant le variant p.M435L a mis en évidence le saut complet de l'exon 16. La même analyse effectuée en utilisant la construction portant la variante p.K232A a montré des différences modérées par rapport à la construction de type p.K232A, suggérant un effet possible de ce variant sur l'épissage de l'intron 7. Enfin, des analyses quantitatives par RT-PCR de cellules transfectées avec la construction porteuse de p.K232A n'ont pas montré de modification significative sur le taux d'épissage des introns 1, 2 et 7. En conclusion, la DGAT1 FLGA a confirmé l'impact de p.M435L précédemment observé in vivo, mais a invalidé l'hypothèse selon laquelle le variant p.K232A diminuait fortement le taux d'épissage de l'intron 7.

La diaglycéride O-acyltransférase 1 codée par le gène DGAT1 est l'enzyme catalysant la synthèse des triglycérides à partir des diglycérides et de l'acyl-coenzyme A. En 2002, le variant faux-sens DGAT1 p.K232A (BTA14:611019AA>GC) était associé à des variations majeures de rendement et composition du lait chez les bovins1. La fréquence de cette variante dépend de la race considérée, mais on la retrouve couramment dans les principales races de vaches laitières. En raison de son impact économique important sur l'industrie laitière, le rôle du variant bovin DGAT1 p.K232A a été largement étudié et revu2. De manière globale, le variant p.K232A a été associé à une baisse du rendement en matière grasse, de la teneur en matière grasse et de la teneur en protéines et à une production laitière plus élevée en protéines et en lactose. D'un point de vue fonctionnel, il a été démontré que ce variant diminuait significativement l'activité enzymatique DGAT1, de manière concordante avec la diminution du pourcentage de matière grasse laitière mesurée chez les porteurs hétérozygotes et homozygotes de p.K232A3. Par ailleurs, l'utilisation d'un site d'épissage cryptique en 5' (5'SS) au sein de l'exon 8 a également été détectée, de manière plus marquée chez les animaux porteurs de l'allèle p.K232. Cependant, ce mécanisme spécifique n'a pas été identifié comme un élément majeur pouvant expliquer les modifications des phénotypes du lait, car la différence en termes de rapport de transcrit anormal/normal entre les animaux homozygotes pour l'allèle p.K232, homozygotes pour l'allèle p.A232 et hétérozygotes était faible3.

Très récemment, Fink et al. ont étudié plus en profondeur la splicogénicité du variant p.K232A en utilisant une approche reposant sur des méthodes complémentaires in vivo et in vitro4. Après avoir effectué une analyse d'association à l'aide d'un ensemble de données d'ARN-seq mammaire représentant 375 vaches en lactation et 3128 variants de séquence précédemment imputés se trouvant dans un intervalle de 1Mbp chevauchant le gène DGAT1, ils ont observé que l'haplotype contenant p.K232A était associé in vivo à une diminution de l'expression de DGAT1 et des modifications du taux d'épissage de plusieurs introns. Fait intéressant, la variante p.K232A était le SNP le plus associé concernant la modification de l'épissage des introns 2 et 7. De plus, un test de minigène dans des cellules épithéliales mammaires bovines (MAC-T) a révélé que cette variante diminuait le taux d'épissage de l'intron 7, ce qui signifie que le p.K232A provoque la modification d'épissage de l'intron 7 observée in vivo.

D'après Fink et al. étude, l'altération du taux d'épissage de l'intron 7 semblait être l'effet d'épissage le plus convaincant directement attribué au variant p.K232A, sur la base de preuves in vivo et in vitro. De plus, les auteurs ont souligné un effet possible de ce variant sur la modification du taux d'épissage de l'intron 2, car il était fortement associé à ce dernier in vivo, mais n'ont pas pu valider cette hypothèse car la construction minigène qu'ils ont développée était dépourvue de DGAT1 introns 1 et 2. Ils ont conclu que l'altération de l'expression du transcrit DGAT1 pourrait contribuer aux effets phénotypiques associés au variant p.K232A.

Le variant p.M435L est une altération rare découverte par Lehnert et al. il y a plusieurs années en examinant les enregistrements de lactation de 2,5 millions de vaches afin d'identifier les écarts significatifs par rapport aux teneurs moyennes en protéines et matières grasses du lait5. Ils ont filtré 29 animaux présentant des paramètres laitiers anormaux, dont une vache présentant une très faible teneur en matières grasses, chez lesquels ils ont ensuite identifié la variante susmentionnée par cartographie génétique et analyse de séquençage. La composition détaillée des échantillons de lait prélevés sur des vaches porteuses de cette variante a également révélé une amélioration substantielle du rapport graisses saturées/insaturées du lait. Dans un second temps, les auteurs ont réalisé une RT-PCR qualitative et quantitative à partir d'ARN totaux extraits de foie de bovins sauvages (WT) d'une part, ou alternativement d'animaux porteurs du variant p.M435L à l'état hétérozygote ou homozygote dans le d'autre part. Ces analyses RT-PCR ont montré que cette variante entraînait un saut presque complet de l'exon 16 de DGAT1. La protéine résultante était exprimée dans Saccharomyces cerevisiae et était incapable de transférer l'acide oléique de la coenzyme A au diacylglycérol. En revanche, la protéine WT exprimée dans les mêmes conditions est capable de catalyser cette étape réactionnelle nécessaire à l'obtention d'un produit enzymatique normal. Cette dernière observation a confirmé le rôle causal de p.M435L dans l'obtention du phénotype de lait anormal rapporté dans cette étude.

Full-length gene assays (FLGA) have been routinely used to analyse numerous splicing variants within the human SPINK1 geneA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="#ref-CR6" id="ref-link-section-d226774577e452">6,7,8,9,10 and 5’SS GT>GC or GC>GT variants in 43 different genesGT and GT>GC variants differ markedly in terms of their functionality and pathogenicity. Hum. Mutat. 41, 1358–1364 (2020)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR11" id="ref-link-section-d226774577e459">11,GC variants capable of generating wild-type transcripts. Hum. Mutat. 40, 1856–1873 (2019)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR12" id="ref-link-section-d226774577e462"> 12. Afin d'évaluer la splicogénicité d'un variant, le test de minigène est plus facile à utiliser que le FLGA et donc plus couramment utilisé. La FLGA présente cependant deux avantages majeurs. Tout d'abord, l'analyse d'un variant d'épissage porté par un transcrit pré-ARNm qui a été généré par un vecteur d'expression épisomique est plus pertinente biologiquement lors de l'intégration de la séquence entière du gène, puisque la nature et la longueur du contexte de la séquence sont connues pour impacter l'ARN structures et processus d'épissage13,14,15. Ensuite, la FLGA permet l'évaluation de tout type de variants génétiques sur l'épissage, y compris les introniques profonds. Par conséquent, nous avons créé un bovin DGAT1 FLGA afin de valider l'effet de p.M435L et p.K232A sur l'épissage dans un système expérimental robuste.

Le transcrit d'ARNm DGAT1 de pleine longueur de l'exon 1 à l'exon 17 a été amplifié à partir de l'ARN total de trois préparations différentes de cellules MAC-T non transfectées à l'aide de la paire d'amorces P1-P2 (Fig. 1A). Un seul amplicon dont la taille correspond à celle du transcrit canonique épissé (c'est-à-dire 1220 pb) a été observé par électrophorèse sur gel (Fig. 1B). En revanche, l'amplification des régions ciblées du transcrit couvrant les exons 7 à 9 et 15 à 17 à l'aide de paires d'amorces P3-P4 et P5-P2, respectivement, a donné plusieurs produits (Fig. 1A, B ; Figure 1 supplémentaire). Ceux-ci ont une taille correspondant au transcrit DGAT1 épissé, mais aussi à la forme non épissée et entre les formes partiellement épissées. Enfin, le génotypage DGAT1 des cellules MAC-T a montré qu'elles étaient homozygotes pour p.A232 (c.694GC) et p.M435 (c.1303A) (Fig. 1C).

Analyse qualitative par RT-PCR du modèle d'épissage endogène DGAT1 dans les cellules MAC-T. (A) Illustration représentant la structure du gène bovin DGAT1. Les boîtes et les lignes bleues représentent respectivement les exons et introns DGAT1 bovins. Les paires d'amorces P1-P2, P3-P4 et P5-P2 sont indiquées en rouge. (B) Électrophorèse sur gel de produits de RT-PCR P1-P2, P3-P4 et P5-P2 obtenus à partir de trois préparations différentes de cellules MAC-T. Les produits épissés (s) et non épissés (u) sont indiqués par des flèches jaunes et leur structure est représentée à droite. (C) Génotype des cellules MAC-T aux positions p.232 et p.435.

La séquence génomique entière de la DGAT1 bovine hébergeant les allèles p.K232 et p.M435 a été insérée avec succès dans le vecteur d'expression pcDNA3.1 (+) pour obtenir la construction pcDNA3.1-DGAT1 (WT) (Fig. 2A), qui a été transfectée dans les lignées cellulaires MAC-T et de rein embryonnaire humain (HEK293T). La RT-PCR qualitative utilisée pour amplifier le transcrit DGAT1 complet a invariablement généré un amplicon d'une taille correspondant au transcrit DGAT1 entièrement épissé attendu dans les deux lignées cellulaires (c'est-à-dire 1450 pb) (Fig. 2B). A noter que ce produit provient exclusivement de la construction pcDNA3.1-DGAT1 puisque les parties 5'UTR et 3'UTR du transcrit ciblées par les amorces P6 et P7 sont liées au vecteur pcDNA3.1 (+) et non au génome bovin , contrairement aux amorces P1 et P2 correspondant respectivement à l'exon 1 et à l'exon 17.

Validation de la DGAT1 FLGA. (A) Illustration représentant la construction pcDNA3.1-DGAT1 (WT). Les boîtes et les lignes bleues représentent respectivement les exons et introns DGAT1 bovins. La ligne noire représente le squelette pcDNA3.1 (+). La paire d'amorces P6-P7 et sa région cible sont indiquées en rouge. (B) Électrophorèse sur gel de produits de RT-PCR P6-P7 obtenus à partir de cellules transfectées avec pcDNA3.1-DGAT1 (WT).

L'effet du variant p.M435L sur le saut de l'exon 16 a été étudié au moyen d'une RT-PCR qualitative englobant les exons 15 à 17 et réalisée sur des cellules transfectées avec les deux constructions pcDNA3.1-DGAT1 (WT) et (M435L) (Fig. 3A ). L'utilisation de la lignée cellulaire humaine HEK293T a été préférée à celles de la lignée cellulaire bovine MAC-T. En fait, l'utilisation d'une lignée cellulaire non bovine était le seul moyen d'éviter l'amplification des transcrits DGAT1 endogènes qui aurait faussé l'analyse, car les amorces de PCR utilisées pour amplifier les transcrits DGAT1 synthétiseront exclusivement les transcrits générés par les constructions pcDNA3.1-DGAT1 car ils sont spécifiques aux bovins.

Analyse qualitative par RT-PCR de cellules HEK293T transfectées avec des constructions pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou M435L). (A) Illustration des constructions plasmidiques utilisées pour la RT-PCR qualitative. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) et pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) portent alternativement les allèles p.M435 ou p.L435, respectivement. Les boîtes et les lignes bleues représentent respectivement les exons et introns DGAT1 bovins. La ligne noire représente le squelette pcDNA3.1 (+). La paire d'amorces P5-P2 et sa région cible sont indiquées en rouge. (B) Électrophorèse sur gel de produits P5-P2 RT-PCR obtenus à partir de cellules HEK293T transfectées avec pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou M435L). La structure des amplicons 1 à 3 est représentée à droite. NT, non transfecté ; RT (-), RT-PCR réalisée sans Exposant III. (C) Validation de la structure de l'amplicon de (B) par séquençage Sanger. Seules les frontières exon-intron et exon-exon sont représentées.

La RT-PCR a donné plusieurs produits (Fig. 3B, C; Fig. 2 supplémentaire) qui ont été purifiés, clonés dans le vecteur pCR4-TOPO TA et séquencés. Trois principaux produits de PCR correspondant à des transcrits non épissés, épissés ou sautés de l'exon 16 ont été identifiés. Des transcrits sautés par l'exon 16 ont été observés dans le contexte des constructions (WT) et (M435L). En revanche, le produit correspondant au transcrit correctement épissé a été observé exclusivement pour la construction (WT).

L'effet qualitatif du variant p.K232A a été étudié selon la même approche que pour le variant p.M435L (Fig. 4A). Aucune différence n'a été trouvée dans la nature des transcrits observés, cependant l'un des produits semble être présent en plus grande quantité pour le variant p.K232A (Fig. 4B, Fig. 3 supplémentaire). Il correspond à une forme intermédiaire partiellement épissée du transcrit, dans laquelle l'intron 7 est toujours présent, en plus des 3 exons amplifiés (Fig. 4C). Une bande très faible et diffuse était à peine visible à un poids moléculaire légèrement supérieur à 100 pb dans les conditions (WT) et (K232A). Il pourrait correspondre à l'isoforme mineure d'épissage alternatif de DGAT1 générée par l'utilisation d'un site d'épissage cryptique au sein de l'exon 8 et décrite dans des études antérieures3,4.

Analyse qualitative par RT-PCR de cellules HEK293T transfectées avec des constructions pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou K232A). (A) Illustration des constructions plasmidiques utilisées pour la RT-PCR qualitative. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) et pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) portent alternativement les allèles p.K232 ou p.A232, respectivement. Les boîtes et les lignes bleues représentent respectivement les exons et introns DGAT1 bovins. La ligne noire représente le squelette pcDNA3.1 (+). La paire d'amorces P3-P4 et sa région cible sont indiquées en rouge. (B) Électrophorèse sur gel de produits P3-P4 RT-PCR obtenus à partir de cellules HEK293T transfectées avec pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou K232A). La structure des amplicons 1 à 3 est représentée à droite. NT, non transfecté ; RT (-), RT-PCR réalisée sans Exposant III. (C) Validation de la structure de l'amplicon de (B) par séquençage Sanger. Seules les frontières exon-intron et exon-exon sont représentées.

Dans l'étude précédente de Fink et al., il a été démontré que le variant p.K232A diminuait considérablement l'épissage de l'intron 7 et était également soupçonné de modifier l'épissage de l'intron 2. Pour cette raison, nous avons conçu une RT-PCR quantitative pour évaluer la relative expression de transcrits épissés et non épissés aux jonctions 2 et 7 (Fig. 5A, B). Nous avons également analysé la jonction 1 car, comme la jonction 2, elle n'a pas été incluse dans l'étude de Fink et al. en raison de contraintes techniques. La lignée cellulaire MAC-T a été sélectionnée pour réaliser l'expérience, car la RT-PCR quantitative permet de quantifier et d'éliminer l'expression endogène de DGAT1, contrairement à la RT-PCR qualitative (Fig. 5A). Les constructions pcDNA3.1-DGAT1 (WT) et (K232A) ont été analysées en parallèle pour déterminer le pourcentage moyen d'épissage, l'expression moyenne des transcrits épissés et l'expression moyenne des transcrits non épissés pour chaque jonction 1, 2 et 7 (Fig. 5C). Des différences ont été observées entre les jonctions pour ces trois paramètres indépendamment de l'allèle testé, illustrant que les jonctions 1, 2 et 7 présentaient une efficacité d'épissage différente. Au contraire, nous n'avons observé aucune différence significative entre les conditions (WT) et (K232A) pour aucun de ces paramètres lors de l'examen d'une jonction donnée.

Analyses quantitatives par RT-PCR de cellules MAC-T transfectées avec des constructions pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou K232A). (A) Flux de travail expérimental d'une expérience quantitative de RT-PCR. (B) Illustration des constructions plasmidiques utilisées pour la RT-PCR quantitative. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) et pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) portent alternativement les allèles p.K232 ou p.A232, respectivement. Les boîtes et les lignes bleues représentent respectivement les exons et introns DGAT1 bovins. La ligne noire représente le squelette pcDNA3.1 (+) ou pcAT7-Glo1. Les paires d'amorces sont indiquées en rouge lors du ciblage des frontières exon-exon et en vert lors du ciblage des frontières exon-intron. Voir les matériaux et les méthodes et le tableau 1 pour plus de détails. (C) Pourcentage moyen d'épissage, expression moyenne des transcrits épissés et expression moyenne des transcrits non épissés pour la jonction 1 (J1), la jonction 2 (J2) et la jonction 7 (J7) calculée à partir de trois indépendants expériences de transfection réalisées en triple exemplaire. Barres, SD. L'expression relative attribuée à l'expression endogène de DGAT1 et à la contamination par l'ADN a été soustraite de celles obtenues dans les conditions de test RT (+) pour calculer l'expression relative finale présentée ici. Aucune différence significative n'a été observée entre les conditions (WT) et (K232A) dans (A, B et C).

Afin de concevoir le test le plus fiable, nous avons pris en considération deux biais techniques qui peuvent avoir diminué la précision des expériences quantitatives de RT-PCR qui sont i) l'expression endogène de DGAT1, et ii) la contamination des échantillons d'ARN par l'ADN plasmidique. La contribution relative moyenne à l'expression relative mesurée dans les conditions de test de ces deux sources d'erreur prises ensemble était inférieure à 5 %, quelle que soit la RT-PCR quantitative considérée (Fig. 6). Comme expliqué dans la section Matériel et méthodes, l'expression relative attribuée à l'expression endogène de DGAT1 et à la contamination par l'ADN a été soustraite de celles obtenues dans les conditions de test RT (+) pour obtenir l'expression relative corrigée présentée sur la figure 5C.

Contribution relative moyenne de l'expression endogène de DGAT1 et de la contamination de l'ADN plasmidique à l'expression relative mesurée par RT-PCR quantitative dans la condition de test RT (+) calculée à partir de trois expériences de transfection indépendantes réalisées en triple exemplaire. Jonction épissée (S), jonction non épissée (U). Barres, SD.

DGAT1 est l'un des gènes les plus étudiés en génétique bovine en raison de son rôle prépondérant dans les phénotypes du lait. Cependant, seules deux variantes de perte de fonction de DGAT1 ont été décrites chez les bovins jusqu'à présent. Les variants p.K232A et p.M435L ont été associés à des défauts d'épissage in vivo4,5. Cependant, leur splicogénicité n'a pas encore été validée dans un système expérimental robuste. Nous avons développé un FLGA DGAT1 pour valider l'effet de ces variants sur l'épissage, car à notre connaissance, c'est le système le plus fiable pour ce type d'analyse. Comme p.M435L a entraîné le saut de l'exon 16 in vivo, nous avons utilisé le FLGA de manière qualitative pour analyser la séquence du transcrit DGAT1 dans la région englobant l'exon 15 à l'exon 17. Le transcrit DGAT1 généré à partir du pcDNA3.1-DGAT1 (WT) portait l'exon 16 et l'introduction de la variation p.M435L dans la construction a entraîné le saut complet de cet exon. Dans l'étude in vivo de Lehnert et al., une très petite quantité de transcrits normalement épissés a été détectée chez des bovins homozygotes pour p.M435L, ce qui est un résultat comparable à ce que nous avons obtenu dans notre système5. Cela a validé l'effet de la variante p.M435L et soutenu l'utilisation de la méthode FLGA pour analyser d'autres variantes d'épissage DGAT1. En utilisant le FLGA, nous avons également observé la présence du transcrit sauté par l'exon 16 en faible quantité dans la condition (WT), ce qui n'est pas observé in vivo. Ceci illustre que bien que la méthode FLGA permette l'étude d'un variant dans le contexte de la séquence complète du transcrit, des différences peuvent persister entre les motifs d'épissage du transcrit endogène et le transcrit obtenu à l'aide de FLGA. Plus généralement, si un système FLGA ne génère pas le transcript attendu ou génère des transcripts inattendus en trop grande quantité, nous vous recommandons de ne pas l'utiliser.

L'analyse qualitative ultérieure de la variante p.K232A a révélé un schéma d'épissage légèrement différent pour cette variante par rapport à la condition WT. Une forme partiellement épissée du transcrit avec rétention de l'intron 7 a été observée en plus grande quantité pour le variant p.K232A. Cette première observation était en accord avec l'hypothèse de Fink et al. que le variant p.K232A diminue le taux d'épissage de la jonction 7, cependant aucune différence n'a été observée entre les conditions WT et p.K232A concernant le produit normalement épissé contenant les exons 7 à 9. Ce dernier point était en contradiction avec les résultats de Fink et coll. D'autre part, il faut garder à l'esprit que la RT-PCR qualitative ne permet pas de quantifier avec précision les produits amplifiés, il a donc fallu développer une RT-PCR quantitative pour résoudre ce problème, comme l'ont fait Fink et al .

Thus, we attempted to replicate the most compelling result from the Fink et al. study which was the decrease in the splicing rate of junction 7 caused by the p.K232A variant4. The possible effects on the splicing of introns 1 and 2 were also tested. In a manner comparable to theirs, we have set up quantitative RT-PCR and we have measured DGAT1 spliced and unspliced transcripts relative expression at each junction, as the average percentage of splicing, in MAC-T cells transfected with pcDNA3.1-DGAT1 constructs. We did not observe any significant difference between (WT) and (K232A) conditions on any splicing parameters related to junction 1, 2 or 7. Conversely, the minigene assay developed by Fink et al. showed a 4-fold increase in terms of spliced transcript relative expression for the p.K232 allele by comparison to the p.A232 allele in the context of the junction 7, what resulted in a dramatic rise of intron 7 splicing ratio. Such a strong discordance may seem a little surprising but it can be explained by differences in terms of methodological choices or technical considerations between both studies. First, and as we have mentioned in the introduction, using a truncated or chimeric genomic sequence of a gene to perform episomal splicing reporter assays is less reliable than using the full gene sequence. A minigene harbouring all exons of a gene but lacking several of its introns as used by Fink et al. may generate strong false positives. This kind of bias has been unmasked by Wu et al., who used FLGA to analyse the human SPINK1 c.194G>A variant previously classified as strongly spliceogenic using minigene assayA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR6" id="ref-link-section-d226774577e945"> 6,16. Ils ont révélé que cette variante n'avait en fait aucun effet sur l'épissage. Par la suite, il est également reconnu que les expériences basées sur des lignées cellulaires peuvent souffrir d'un manque de reproductibilité, en particulier lorsqu'elles sont réalisées par différents expérimentateurs, dans différents laboratoires et en utilisant différentes préparations cellulaires17. Cela peut avoir contribué à des résultats contradictoires entre notre étude et celle de Fink et al.

Nous avons conclu que cette variante n'avait pas d'impact substantiel sur l'épissage des jonctions DGAT1 1, 2 et 7 en soi. Par ailleurs, nos résultats sont cohérents avec le fait que les variations en termes d'expression et d'efficacité d'épissage observées in vivo sont très faibles, de l'ordre de quelques pour cent4. Ces petites variations peuvent ne pas être détectées par RT-PCR quantitative. Nous pensons que le variant p.K232A a probablement un petit effet sur l'épissage par lui-même, ce qui est soutenu à la fois par le fait qu'il est situé dans un amplificateur d'épissage exonique4 et que nous avons observé un effet possible par analyse qualitative RT-PCR, mais qui reste relativement anecdotique par rapport à son effet sur la fonction protéique. Comme suggéré ci-dessus, l'effet très fort de cette variante sur l'épissage de la jonction 7 comme observé par Fink et al. dans leur système de minigènes était probablement un artefact lié à des choix méthodologiques non optimaux.

La dernière question abordée dans notre travail concernait la pertinence de vérifier l'impact de certains biais techniques lors de l'utilisation de tests minigènes ou FLGA. Selon la conception de la RT-PCR, la quantification spécifique de l'ARNm produit par un plasmide d'expression peut être un problème en raison i) de la confusion entre l'expression endogène et épisomique du gène cible, et ii) de la contamination de l'ARN total par le plasmide DNA18. L'interférence entre les expressions endogènes et épisomiques peut être évitée de deux manières. Premièrement, en utilisant des amorces spécifiques à l'espèce pour amplifier exclusivement la cible à partir d'une construction plasmidique, en combinaison avec une lignée cellulaire d'une espèce différente mais génétiquement étroitement liée, comme nous l'avons fait pour p.M435L. Alternativement en utilisant une lignée cellulaire dans laquelle le gène cible n'est pas du tout exprimé. L'emploi d'une lignée cellulaire provenant d'un tissu ou d'une espèce différente de celles du gène cible n'est pas vraiment un problème puisque le code d'épissage est hautement conservé entre des espèces étroitement apparentées19, de même que des lignées cellulaires isolées de différents organes ont montré la plupart des les résultats comparables dans le temps lorsqu'ils sont utilisés pour effectuer des tests de rapporteur d'épissage20. Par exemple, les cellules HEK293T ont été utilisées avec succès pour analyser des centaines de variants dans des dizaines de gènes exprimés dans de nombreux tissus différents à l'aide de dosages minigènes et midigènes ou FLGA (pour des exemples, voir les références citées dans l'introduction ou21,22,23). De plus, nous avons montré que la contamination plasmidique peut être réduite à un taux acceptable en utilisant un traitement à la DNase. Une autre option pour éviter toute amplification de l'ADN plasmidique contaminant est de concevoir des amorces RT-PCR uniquement sur des exons séparés par des introns suffisamment longs, mais ce n'est pas toujours possible24. Dans les conditions expérimentales que nous avons utilisées pour effectuer une RT-PCR quantitative dans des cellules MAC-T, l'expression endogène et la contamination plasmidique prises ensemble comptaient pour moins de 5 % de l'expression relative de DGAT1 en moyenne. Une telle contamination peut être considérée comme faible et ne représente pas une source majeure d'erreur. Nous aurions pu l'ignorer lors du calcul de l'expression relative DGAT1 sans que cela modifie significativement les résultats. Néanmoins, nous pensons que tout le monde devrait en être conscient avant de commencer un test minigène ou FLGA, et quantifier ce niveau de contamination si la conception RT-PCR est susceptible de permettre l'amplification de transcrits endogènes ou de plasmides contaminants. En effet, si ces contaminations sont élevées, cela peut altérer la fiabilité des résultats. Enfin, il est important de préciser que la contamination plasmidique est un problème qui doit également être pris en compte lors de la réalisation d'une RT-PCR qualitative. Pour de telles RT-PCR, il n'est pas possible de quantifier la contamination et de la soustraire du signal d'intérêt, comme nous l'avons fait pour les RT-PCR quantitatives. Il est donc nécessaire de faire un effort supplémentaire pour éliminer toute trace de contamination par l'ADN plasmidique dans les ARN, par exemple en faisant une étape supplémentaire de traitement à la DNAse.

En guise de remarques finales, nous encourageons l'utilisation de la méthode FLGA pour analyser les variants splicogéniques car il s'agit du test de rapporteur d'épissage épisomique le plus robuste, en particulier pour analyser les variants d'épissage hypomorphique ou les variants impliquant des mécanismes complexes. Bien sûr, le test minigène reste un outil utile qui s'intègre bien dans de nombreuses situations en combinaison avec des données fonctionnelles, génétiques et phénotypiques complémentaires.

Un fragment de 8218 pb contenant la séquence génomique DGAT1 de la fin du premier exon au début du dernier exon (chr14 : 604 331-612 548) a été amplifié à partir d'un échantillon d'ADN génomique bovin. Il a été obtenu à partir d'une vache Holstein portant le variant DGAT1 p.K232A à l'état hétérozygote, dont le génome entier avait été préalablement séquencé25. La PCR à longue portée a été réalisée avec 100 ng d'ADN dans un mélange réactionnel de 50 µL préparé sur de la glace contenant 25 µL de 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche) et 0,3 µM de chaque amorce C1 et C2 (tableau 1). Le programme de PCR comportait une dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, 32 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 20 s, un recuit à 70 °C pendant 15 s, une extension à 72 °C pendant 8 min 30 s et une finale étape d'extension à 72 ° C pendant 1 min. Les amplicons ont été purifiés avec le kit QIAquick PCR Purification (Qiagen). Le plasmide d'expression pcDNA3.1 (+) a été double digéré par BamHI et XhoI avant insertion des amplicons précédemment générés au moyen du kit de clonage In Fusion HD (Takara), selon les instructions du fabricant. Plusieurs constructions résultant de ce processus ont été analysées par séquençage de Sanger pour vérifier la séquence aux positions p.232 et p.435. Un plasmide portant les allèles p.K232 et p.M435 a été sélectionné pour être la construction pcDNA3.1-DGAT1 (WT), puis produit avec le kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) ou le NucleoBond Xtra Midi EF (Masherey Nagel) et quantifié à l'aide un NanoDrop™ One (Thermo Scientific). Enfin, la construction a été validée par double digestion avec BamHI et XhoI et la séquence du gène DGAT1 inséré dans la construction ainsi que celle de l'ADN génomique utilisé pour le clonage ont été entièrement vérifiées par séquençage Sanger. Deux mutations indésirables ont été introduites dans la construction lors de l'étape d'amplification PCR (ie BTA14:607550C>T, BTA14:608021C>T), mais elles étaient situées en dehors des sites d'épissage et loin des deux variants étudiés.

Les variants DGAT1 p.M435L (c.1303A>C) et p.K232A (c.694AA>GC) ont été introduits dans la construction pcDNA3.1-DGAT1 (WT) au moyen du kit de mutagenèse dirigée QuikChange II XL (Agilent Les technologies). La mutagenèse a été réalisée dans un mélange de 51 μl contenant 2,5 U d'ADN polymérase PfuUltra HF, 1 μl de mélange de dNTP, 5 μl de tampon de réaction 10×, 3 μl de QuikSolution, 20 ng de pcDNA3.1-DGAT1 et 125 ng de chaque amorce de mutagenèse M1 et M2 ou alternativement M3 et M4 (tableau 1). Le programme PCR comportait une dénaturation initiale à 95 °C pendant 1 min, suivie de 18 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 50 s, un recuit à 60 °C pendant 50 s et une extension à 68 °C pendant 28 min, et un extension finale à 68 ° C pendant 7 min. Le mélange réactionnel post-PCR a été traité avec DpnI à 37 ° C pendant 1 heure, puis 4 µL des produits résultants ont été transformés dans des cellules XL10-Gold Ultracompetent (Agilent Technologies). Les cellules transformées ont été étalées sur des plaques de gélose LB avec 50 µg/ml d'ampicilline puis plusieurs colonies sélectionnées ont été utilisées pour préparer des productions de plasmide miniprep avec le kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Les plasmides Miniprep ont été analysés par séquençage Sanger afin de vérifier l'introduction réussie de la substitution souhaitée et une production à grande échelle de plasmide NucleoBond Xtra Midi EF a été réalisée et quantifiée pour chaque variante. Les constructions hébergeant les variantes p.M435L et p.K232A ont été nommées pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) et pcDNA3.1-DGAT1 (K232A), respectivement.

Les cellules HEK293T ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Gibco) avec 10 % de sérum de veau fœtal (Sigma Aldrich). Les cellules MAC-T ont été cultivées dans du DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal additionné de 4 mM de L-glutamine, 1 % de pénicilline/streptomycine, 1 µg/L d'hydrocortisone et 50 mg/L d'insuline. Vingt-quatre heures avant la transfection, 3 × 105 cellules ont été ensemencées par puits dans des plaques à six puits. Pour l'analyse qualitative de la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse (RT-PCR), 1 μg de plasmides pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou M435L) extraits à l'aide du kit QIAprep Spin Miniprep, mélangés à 3 μl de réactif de transfection Lipofectamine 2000 (Invitrogen), ont été utilisés pour transfection par puits. Pour les analyses RT‐PCR quantitatives en temps réel, pcDNA3.1-DGAT1 (WT ou K232A) ont été mélangés avec pcAT7-Glo1 à un rapport équimolaire afin d'atteindre une quantité totale de 1 µg, puis mélangés avec 3 µL de réactif de transfection Lipofectamine 2000. Les plasmides utilisés pour la RT-PCR quantitative ont tous été extraits à l'aide de NucleoBond Xtra Midi EF. Le vecteur pcAT7-Glo1 utilisé dans cette étude a été fourni par Scott I. Adamson et Brenton R. Graveley à l'Université du Connecticut, et était la version modifiée du plasmide dans lequel un site accepteur d'épissage au milieu de l'intron 1 a été supprimé20 . Pour la condition de contrôle de fond, pcDNA3.1-DGAT1 a été remplacé par pcDNA3.1 (+) plasmide vide en utilisant les mêmes quantités molaires. Il convient de noter que le plasmide pGL3-basique (Promega) a été ajouté au mélange pour maintenir la quantité finale de 1 µg constante puisque pcDNA3.1 (+) avait un poids moléculaire inférieur à celui de pcDNA3.1-DGAT1. Quarante‐huit heures après la transfection, l'ARN total a été extrait à l'aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen) en ajoutant un traitement à la DNase sur colonne. Les ARN destinés à la RT-PCR qualitative soumis à une interférence avec la contamination plasmidique (c'est-à-dire les RT-PCR P5-P2 et P3-P4 réalisées dans le cadre de la FLGA ; voir ci-dessous pour une description de la conception de la RT-PCR) ont été soumis à un nettoyage d'ARN supplémentaire étape à l'aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen). La RT a été réalisée avec le système de synthèse SuperScript III First-Strand pour RT-PCR (Invitrogen) avec 1 µg d'ARN, 2,5 µM Oligo(dT) 20, 500 µM chaque dNTP, 5 mM MgCl2, 5 mM dithiothréitol, 40 U RNaseOUT et 200 U Exposant III en suivant les instructions du fabricant. Alternativement, seuls 100 ng d'ARN ont été utilisés pour les RT-PCR qualitatives P5-P2 et P3-P4 réalisées dans le cadre de la FLGA. L'ADN complémentaire (ADNc) a été dégradé avec 2 U RNaseH (Invitrogen). Pour chaque échantillon d'ARN, un contrôle négatif sans enzyme SuperScript III a été effectué pour évaluer la contamination de l'ADN dans les échantillons d'ARN total.

Fondamentalement, une RT-PCR qualitative a été réalisée dans un mélange réactionnel de 50 µL contenant 1,25 µL d'ADN polymérase GoTaq® (Promega), 1,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTP, 0,5 µM de paires d'amorces "P" comme décrit dans le tableau 1 et 2 µL d'ADNc. Notez que 5 µL d'ADNc ont été utilisés pour la RT-PCR qualitative P5-P2 et P3-P4 réalisée dans le cadre de la FLGA. Les paires d'amorces P1-P2, P3-P4, P5-P2 et P6-P7 ont été utilisées pour amplifier les régions englobant les exons 1 à 17, les exons 7 à 9, les exons 15 à 17 et pcDNA3.1 5'UTR à 3'UTR, respectivement . Le programme PCR comportait une dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 min, suivie de 30 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, un recuit à 58 °C pendant 30 s, une extension à 72 °C pendant 1 min 30 s, avec une étape d'extension finale à 72 ° C pendant 5 min. Les principaux produits de PCR ont été purifiés sur gel et clonés dans le vecteur pCR4-TOPO TA (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. La séquence des clones correspondant à chaque transcrit à identifier a ensuite été vérifiée par séquençage de Sanger à l'aide des amorces universelles M13 sens et antisens.

L'ARN total extrait des cellules MAC-T co-transfectées avec pcDNA3.1-DGAT1 et pcAT7-Glo1 a été analysé par RT-PCR quantitative. pcAT7-Glo1 a été utilisé comme gène de référence pour calculer l'expression relative des jonctions épissées ou non des transcrits provenant de pcDNA3.1-DGAT1, conformément au modèle de calcul corrigé de l'efficacité de Pfaffl26. Comme décrit dans la figure 5B et dans le tableau 1, l'expression des transcrits épissés de DGAT1 a été quantifiée à l'aide de paires d'amorces couvrant deux exons consécutifs, qui sont Q1 dans l'exon 1 et Q2 dans l'exon 2 pour la jonction 1, Q4 dans l'exon 2 et Q5 dans l'exon 3 pour jonction 2, en plus de Q7 dans l'exon 7 et Q8 dans l'exon 7/8 pour la jonction 7. L'expression des transcrits non épissés de DGAT1 a été quantifiée à l'aide de paires d'amorces couvrant un exon et l'intron suivant, c'est-à-dire Q1 dans l'exon 1 et Q3 dans l'intron 1 pour jonction 1, Q4 dans l'exon 2 et Q6 dans l'intron 2 pour la jonction 2, en plus de Q7 dans l'exon 7 et Q9 dans l'intron 7 pour la jonction 7. Pour éviter les biais expérimentaux, l'expression endogène de MAC-T DGAT1 à partir de cellules transfectées avec pcDNA3 vide .1 (+) a été mesuré en parallèle dans chaque expérience de transfection et soustrait de ceux de pcDNA3.1-DGAT1 pour éliminer le signal de fond (Fig. 5A). De plus, le contrôle négatif RT-PCR RT (-) a été utilisé pour évaluer la contamination putative par l'ADN plasmidique dans chaque échantillon d'ARN utilisé dans la condition de test, et pour permettre de la soustraire de l'expression relative de DGAT1 mesurée dans l'expérience RT (+) de la condition d'essai. Il a été obtenu en réalisant la DGAT1 RT-PCR sans l'enzyme Superscript III. Après avoir effectué des PCR DGAT1 sur des échantillons RT (-), le calcul de l'expression relative de DGAT1 générée par la contamination plasmidique dans chaque échantillon d'ARN a été effectué en exprimant le signal DGAT1 de l'expérience RT (-) par rapport au signal de référence de la RT correspondante ( +) expérience. Ensuite, l'expression relative de DGAT1 résultante représentant la contamination par l'ADN plasmidique a été soustraite de celles de la DGAT1 RT-PCR évaluant l'expression relative des transcrits épissés et non épissés dans les conditions de test RT (+) pour obtenir l'expression relative de DGAT1 corrigée présentée sur la figure 5C. Enfin, le pourcentage moyen d'épissage observé à une jonction donnée a été obtenu en divisant l'expression moyenne des transcrits épissés par l'expression moyenne des transcrits totaux. Trois expériences de transfection indépendantes ont été analysées en triple pour chaque condition, et la différence observée entre pcDNA3.1-DGAT1 (WT) et (K232A) dans chaque type d'analyse a été évaluée pour sa signification par le test t de Student avec seuil p < 0,05.

Techniquement, des RT-PCR quantitatives ont été réalisées en triple exemplaire sur un QuantStudio 12k Flex (Applied Biosystems). Le mélange réactionnel contenait 10 µL SYBR™ Master Mix PCR Power SYBR™ Green (Applied Biosystems), 0,6 µM de paires d'amorces "Q" comme décrit dans le Tableau 1 et la Fig. 5B, et 5 µL d'ADNc dilué 40 fois dans un volume total de 20 µL. Le programme PCR comportait une première étape à 50 °C pendant 2 min et une deuxième étape à 95 °C pendant 10 min, suivies de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, et d'hybridation et d'extension à 60 °C pendant 1 min. Il a ensuite été suivi d'un programme de courbe de fusion consistant en 95 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 1 min et 95 ° C pendant 15 s.

Un culot contenant 1,5 million de cellules MAC-T a été utilisé pour effectuer une extraction d'ADN à l'aide du kit Puregene cell & tissue (Qiagen). Les régions génomiques couvrant les exons 7 à 9 et 15 à 17 de DGAT1 ont été amplifiées par PCR à partir de cet ADN en utilisant des paires d'amorces P3-P4 et P5-P2, respectivement, dans les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus dans "Qualitative RT-PCR". Les amplicons résultants ont été analysés par séquençage Sanger en utilisant les mêmes amorces pour déterminer le génotype MAC-T aux positions p.232 et p.435 sur le gène DGAT1.

Les auteurs confirment que les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article.

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Le vecteur pcAT7-Glo1 était un aimable cadeau de Scott I. Adamson et Brenton R. Graveley de l'Université du Connecticut. La lignée cellulaire HEK293T est un aimable cadeau de Sophie Dhorne-Pollet de l'unité GABI de l'INRAE.

Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, GABI, 78350, Jouy-en-Josas, France

Nicolas Gaiani, Lorraine Bourgeois-Brunel, Dominique Rocha & Arnaud Boulling

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NG et AB : ont conçu et conçu cette étude. NG et LBB : ont réalisé les expériences. NG, DR et AB : ont analysé les données. AB : rédaction — préparation du projet original. NG, DR et AB : rédaction—révision et édition. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Correspondance à Arnaud Boulling.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Gaiani, N., Bourgeois-Brunel, L., Rocha, D. et al. Analyse de l'impact des variants DGAT1 p.M435L et p.K232A sur l'épissage du pré-ARNm dans un test génétique pleine longueur. Sci Rep 13, 8999 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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Reçu : 11 janvier 2023

Accepté : 30 mai 2023

Publié: 02 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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