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Jul 13, 2023

Analyse de β

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9180 (2023) Citer cet article

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Le facteur de croissance du nerf β (NGF) est une neurotrophine qui joue un rôle essentiel dans le développement du fœtus pendant la gestation. Le ProNGF est la forme précurseur du NGF avec un profil biologique distinct. Afin d'étudier le rôle du NGF et du proNGF chez les femelles humaines enceintes, un test de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide d'immunoaffinité sensible et sélectif a été développé et qualifié pour mesurer simultanément les niveaux de NGF total (tNGF ; somme de mature et de proNGF) et de proNGF en utilisant respectivement des stratégies de quantification complète et relative. Le test a été utilisé pour déterminer les taux sériques de tNGF et de proNGF au cours des trois trimestres de gestation de la grossesse et chez des femmes témoins non enceintes. Le tNGF moyen ± ET était de 44,6 ± 12,3, 42,6 ± 9,3, 65,4 ± 17,6 et 77,0 ± 17,8 pg/mL pour les premiers, deuxième et troisième trimestres, respectivement, sans grossesse, ne démontrant aucune augmentation significative du tNGF circulant entre le témoin et le premier trimestre, et une augmentation modérée mais significative de 1,7 fois pendant la gestation. Les niveaux de proNGF au cours du premier trimestre étaient inchangés par rapport au contrôle. Contrairement au tNGF, cependant, les niveaux de proNGF pendant la gestation sont restés stables sans changements significatifs. Le développement de ce nouveau test duplexé d'immuno-affinité sensible pour le tNGF et le proNGF devrait permettre d'élucider davantage les rôles que jouent ces neurotrophines dans la grossesse humaine ainsi que dans d'autres modèles.

Le facteur de croissance du nerf β (NGF) et son précurseur, le proNGF, sont des neurotrophines importantes qui ont des fonctions différentes. Le NGF favorise la croissance, le développement et la différenciation neuronale et est généralement neuroprotecteur1, tandis que le proNGF a une fonctionnalité apparemment contradictoire2 et a été trouvé surexprimé dans les cancers de la thyroïde par rapport à la normale3. Les rapports publiés indiquent à la fois un soutien pour la croissance et la survie des neurones4,5, ainsi que la mort neuronale6,7. Le proNGF est la forme dominante qui existe dans le cerveau, avec peu ou pas de NGF mature présent8,9. Il est intéressant de noter que le rôle du rapport entre le proNGF et le NGF mature dans les cellules neurales10,11 et par la suite le rôle de l'expression et de la signalisation des récepteurs8,12,13 par ces protéines distinctes semblent être des facteurs importants dans les conditions neurodégénératives14,15. Les deux protéines existent en équilibre, et la modification de cet équilibre peut les amener à fonctionner de manière antagoniste l'une envers l'autre16. Par exemple, une maturation défectueuse du NGF, entraînant ainsi un rapport proNGF/NGF mature plus élevé dans le cerveau des rats, contribue à la progression précoce de l'encéphalopathie diabétique induite expérimentalement17. De plus, un rapport déséquilibré entre le proNGF et le NGF mature semble être un indicateur précoce des complications du diabète en général18. Une mauvaise régulation ou un dysfonctionnement du NGF peut également être impliqué dans des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer19,20,21,22, la dégénérescence maculaire liée à l'âge23,24,25,26, une lésion rétinienne27 et la sclérose en plaques28, et le NGF a également été étudié pour une rôle thérapeutique dans la maladie neurodégénérative glaucome24. Depuis sa découverte et son isolement29,30, il est reconnu que le NGF a des effets sur le développement du système nerveux31,32,33 et joue un rôle clé dans la modulation nociceptive chez l'adulte34,35. Par conséquent, le NGF a été largement étudié pour son importance thérapeutique et est de plus en plus recherché comme cible thérapeutique potentielle dans la douleur nociceptive et l'oncologie36,37.

Les neurotrophines sont également impliquées dans les processus liés à la grossesse. Il a été démontré que l'expression maternelle et fœtale du NGF est élevée du premier au troisième trimestre de la grossesse, ce qui implique un rôle important à la fois dans l'implantation des ovules et dans l'augmentation de la vascularisation maternelle aux derniers stades de la grossesse38,39. Il a été démontré que la supplémentation en NGF augmente la vascularisation de l'endomètre chez certains mammifères40, ce qui pourrait expliquer une compensation de la vascularisation pour l'augmentation du NGF dans la circulation placentaire chez les naissances prééclamptiques41, tandis que des taux inférieurs de NGF dans le plasma ombilical et placentaire sont associés aux naissances prématurées42. En outre, des niveaux inférieurs de NGF dus à un facteur extérieur tel que la dépendance aux opioïdes sont associés à des issues de grossesse défavorables significativement plus élevées, notamment des anomalies cognitives, des décès néonatals, des problèmes respiratoires et des scores d'Apgar inférieurs43.

Le rapport entre le proNGF et le NGF mature peut également jouer un rôle similaire à celui des troubles neurodégénératifs décrits ci-dessus, mais il est probablement responsable de la dégradation des nerfs sympathiques utérins pendant la gestation et de la réinnervation des nerfs utérins pendant la récupération post-partum44,45, et une distribution déséquilibrée du NGF dans le tissu placentaire est associée à des fausses couches chez l'homme46. Les taux de NGF se sont avérés élevés chez les nouveau-nés humains au jour 4 par rapport au sang du cordon ombilical (après une diminution initiale au jour 1), tandis que les autres neurotrophines ont diminué de manière significative47. Parallèlement aux associations positives d'interleukines spécifiques avec la résistance et la sécrétion d'insuline, le NGF était plus élevé chez les patientes atteintes de diabète gestationnel et fortement lié au métabolisme du glucose, à la résistance à l'insuline et à la fonction des cellules β pancréatiques chez les femmes enceintes chinoises au cours du deuxième trimestre.

Des travaux antérieurs utilisant le test LCMS pour le NGF ont démontré une augmentation importante et continue de l'expression du NGF (jusqu'à ~ 78 ×) pendant la gestation chez les singes cynomolgus, sans différence dans les niveaux circulants entre les mâles et les populations témoins femelles non enceintes48. Bien qu'une forte augmentation des taux circulants de tNGF ait été démontrée chez les singes cynomolgus48, ce phénomène n'a pas été signalé chez les femmes enceintes, ce qui semble indiquer des différences spécifiques à l'espèce pendant la grossesse. Alors qu'un équilibre des niveaux systémiques de NGF est important pour une progression optimale de la grossesse, l'expression de l'ARNm du NGF dans la grossesse humaine normale par rapport aux patientes avortées spontanées à partir de trophoblastes isolés a montré une augmentation d'environ 2 à 8 fois de ce dernier. Ce résultat était cohérent avec l'avortement spontané chez les modèles de souris lorsqu'une dose supraphysiologique de NGF était administrée en début de grossesse46, et il a été démontré que les niveaux de NGF augmentaient chez les souris en lactation post-gestationnelles49. Curieusement, les niveaux de NGF dans l'utérus du rat sont réduits au milieu et à la fin de la grossesse par rapport aux témoins, ce qui est corrélé à la dégénérescence connue du nerf myométrial45. De même, l'expression du NGF est élevée dans le diabète sucré et il s'est avéré être un facteur protecteur dans la neuropathie diabétique et la vasculopathie50,51,52,53, mais elle était également élevée et impliquée dans la résistance à l'insuline chez les femmes chinoises diabétiques gestationnelles au cours du deuxième trimestre54. Lobos et al. ont également démontré que les niveaux de proNGF augmentent pendant la gestation, probablement en raison d'une transformation altérée de la forme pro en forme mature44,45.

Collectivement, les études susmentionnées ont fait progresser la connaissance des divers rôles du NGF et du proNGF pendant la grossesse. Cependant, l'analyse du NGF et du proNGF a été réalisée dans l'ensemble sans dosages sélectifs qualifiés et les ensembles de données rapportés semblent à la fois comparables et divergents. Par conséquent, il reste à confirmer si les différences signalées dans les concentrations de NGF et de proNGF, et donc les conclusions atteintes, au moins dans certains cas, peuvent être faussées par les différences et la variabilité des dosages16. Cela souligne la nécessité de caractériser, éventuellement d'améliorer et de qualifier les dosages proNGF et NGF pour gagner en confiance dans les conclusions16.

En utilisant une approche de spectrométrie de masse en tandem immunoaffinité-chromatographie liquide (IA-LC – MS/MS) précédemment qualifiée pour la quantification du tNGF dans le sérum humain, nous avons étendu le test pour inclure une quantification relative du proNGF. Avec cette analyse utilisant un test de spectrométrie de masse hautement sélectif et sensible, nous avons l'intention de confirmer les niveaux de tNGF pendant la gestation humaine et d'incorporer une mesure quantitative relative de la protéine précurseur. La capacité du test à discerner le proNGF permet d'évaluer les changements dans les taux sériques de proNGF pendant la grossesse. Nous avons utilisé cette approche pour évaluer les taux de tNGF et de proNGF dans le sérum de femmes enceintes vers le milieu de chaque trimestre par rapport à une cohorte de femmes non enceintes. Ces données peuvent maintenant être utilisées pour mieux comprendre le rôle du NGF et du proNGF pendant la gestation dans la grossesse humaine.

Un peptide de substitution pour le proNGF était nécessaire pour donner une représentation équimolaire de la protéine proNGF ; c'est-à-dire que pour chaque mole de proNGF, 1 mole du peptide de substitution devait être générée après traitement avec la trypsine. Un peptide trypsique VLFSTQPPR dérivé de la région propeptidique du proNGF a été sélectionné sur la base de critères spécifiques pour répondre aux objectifs de l'essai tel que décrit ici : principalement la spécificité au peptide proNGF dans un domaine non présent dans la forme mature du NGF ; deuxièmement, une antigénicité prédite élevée permettant la génération d'un anticorps antipeptide spécifique ; enfin, la possibilité d'obtenir un signal robuste dans le spectromètre de masse. Le deuxième peptide trypsique utilisé dans cette étude était IDTACVCVLSR, qui était auparavant utilisé dans les dosages LC-MS/MS pour les mesures de NGF. Les critères de sélection du peptide IDTACVCVLSR ont été précédemment décrits55. Ce peptide est proche de l'extrémité C-terminale des protéines NGF et proNGF matures et représente donc les contributions des deux formes protéiques dans une mesure combinée du tNGF.

Nécessaire au développement du dosage, l'anticorps de capture utilisé pour ce dosage devrait être capable de se lier à la fois au NGF mature et au proNGF. La liaison de l'anticorps polyclonal de capture aux deux protéines est confirmée par la détection spécifique des deux peptides de substitution. En outre, avant l'étude de qualification, des sondages répétés des surnageants après enrichissement en anticorps à partir de sérum humain ont confirmé que l'anticorps de capture a une récupération presque complète des deux formes protéiques.

La méthode a été qualifiée avec trois lots individuels exécutés à des jours différents. La plage de quantification dans le sérum humain pour le tNGF est de 10,0 à 640 pg/mL en utilisant des critères d'acceptation de précision relative < 25 % (30 % à LLOQ). Huit niveaux de concentration standard d'étalonnage (y compris le point 0) ont été représentés dans les courbes finales avec un minimum de six points non nuls requis. Une courbe d'étalonnage typique obtenue lors de la qualification du test est illustrée à la Fig. 1A. La plage de CV pour toutes les normes d'étalonnage était de 4,80 à 16,6 % et une plage de RE de -5,20 à 12,4 %. Seuls quatre points d'étalonnage individuels ont été retirés des courbes d'étalonnage tout au long des trois séries de lots distinctes. Hors acceptation, des points de courbe individuels ont été supprimés et l'ajustement de la courbe a régressé. La précision et l'exactitude relative du tNGF ont été évaluées dans le même lot de sérum tout au long de l'étude de qualification, ce qui a donné une moyenne inter-essai de 30,0 pg/mL (QC2 ; niveau de tNGF endogène), avec la double dilution de QC2 (QC1) ayant un inter-essai moyenne de 12,8 pg/mL. Pour les CQ dopés, c'est-à-dire QC3 et QC4, la moyenne inter-essai déterminée pour le niveau endogène de NGF dans QC2 a été ajoutée à la concentration de NGF dopé pour calculer la précision relative. Les données de CQ individuelles, intra- et inter-essais et les statistiques récapitulatives pour le tNGF sont présentées dans le tableau 1.

(A) Courbe d'étalonnage représentative pour le tNGF. (B) tNGF dans les échantillons de grossesse (1) contrôle, (2) 1er trimestre, (3) 2ème trimestre, (4) 3ème trimestre. (C) proNGF (1) contrôle, (2) 1er trimestre, (3) 2ème trimestre, (4) 3ème trimestre.

Pour les CQ dopés, c'est-à-dire QC3 et QC4, la moyenne inter-essai déterminée pour le niveau endogène de tNGF dans QC2 a été ajoutée à la concentration de NGF dopé pour calculer la précision relative. Les données de CQ individuelles et inter-essais et les statistiques récapitulatives pour le tNGF sont présentées dans le tableau 1.

La précision et l'exactitude relative du proNGF ont été démontrées sur les trois mêmes lots utilisés pour la qualification du tNGF sur trois jours distincts à cinq niveaux différents. Les valeurs indiquées dans le tableau 2 sont les rapports de surface de pic (PAR) du signal du peptide léger au signal du peptide lourd. Le pourcentage d'erreur relative (RE %), en tant que mesure de la précision relative, a été calculé à l'aide des valeurs PAR moyennes déterminées expérimentalement pour les CQ bas et élevés (proQCL et proQCH) et en comparant la réponse expérimentale avec la réponse PAR théorique extrapolée pour les CQ de mélange (proQCM1 , proQCM2 et proQCM3). La moyenne inter-essai, le CV % et le % RE pour les CQ de qualification proNGF étaient proQCL 0,0699, 18,4 % (pas de RE) ; proQCM1 : 0,115, 25,6 %, 19,1 % ; proQCM2 : 0,131, 22,4 %, 7,09 % ; proQCM3 0,156, 15 %, 4,69 % ; proQCH : 0,175, 18,2 % (pas de RE) respectivement. La plage de CV inter-dosage du proNGF était de 15,0 à 25,6 %, avec une plage de RE de 4,69 à 19,1 %.

Nous avons observé une différence de 2,6, 2,5 et 2,0 fois dans les signaux entre le proQCH et le proQCL pour les essais de qualification 1, 2 et 3 respectivement, ce qui donne une différence moyenne de 2,37 fois tout au long de la qualification (Fig. 2).

ProNGF L:H PAR moyen (rapport de surface de pic léger: lourd) pour tous les CQ de proNGF générés en mélangeant proQCL avec proQCH montrant une augmentation de 2,37 fois du proNGF L:H PAR de proQCL à proQCH.

Au cours de l'analyse des échantillons, toutes les valeurs de tNGF pour les CQ et les inconnues ont été exécutées en parallèle sur deux plaques à 96 puits avec une courbe d'étalonnage à quatre répétitions, et les échantillons de CQ répartis entre les deux plaques. Les erreurs relatives ont été calculées en utilisant le niveau endogène mesuré pour QC2 à la date de l'analyse, ajouté à la quantité de NGF dopé (tableau S1). Les CQ du proNGF ont satisfait aux critères d'acceptation basés sur le CV et l'erreur relative par rapport à la concentration nominale déterminée par le niveau de proNGF mesuré pour le proQCL et le proQCH à la date de l'analyse, en utilisant la moyenne du proQCH et du proQCL avec le schéma de mélange approprié pour calculer la valeur théorique. ratio pour proQCM2 (tableau S2).

Les valeurs de tNGF et de proNGF dans la cohorte sont regroupées par trimestre ainsi que le témoin non enceinte (Fig. 3). Les données montrent des augmentations significatives des taux circulants de tNGF du groupe témoin aux deuxième et troisième trimestres, et aucune augmentation significative des taux circulants de proNGF dans ces mêmes groupes. Aucune covariable n'a été trouvée significativement associée au tNGF. Nous avons obtenu des informations sur l'âge des 103 patients et une analyse associée à l'âge a été effectuée sur les deux peptides. Parmi 103 patients avec des données sur le tNGF, la corrélation de rang entre l'âge des sujets individuels et le tNGF est de -0,153 avec une valeur p de 0,126. La corrélation de rang entre l'âge des sujets individuels et le proNGF est de 0,124 avec une valeur p de 0,220. Dans un modèle de régression linéaire, ajusté pour le trimestre, il n'y a pas d'association significative entre le tNGF et l'âge avec une valeur p de 0,079 ; ou entre le proNGF et l'âge avec une valeur p de 0,173 (Figure S1). Les chromatogrammes ioniques représentatifs pour le tNGF et le proNGF de sujets témoins non enceintes sélectionnés, des sujets du premier, du deuxième et du troisième trimestre sont présentés sur les figures 1B, C respectivement. Les valeurs individuelles pour la cohorte de grossesses humaines pour le tNGF et le proNGF peuvent être trouvées dans les informations supplémentaires (tableau S3 et tableau S4, respectivement).

(A) Niveaux de tNGF et (B) de proNGF dans les cohortes de non-grossesse et de grossesse ventilés par trimestre. Sous chaque graphique figurent la moyenne et l'écart type (SD) pour chaque groupe ainsi que la valeur p par rapport au groupe témoin (non enceinte). Les lignes indiquent la moyenne de chaque groupe.

Dans ce rapport, nous décrivons à la fois la mesure quantitative du tNGF dans le sérum humain à l'aide de l'IA-LC-MS/MS55 d'une cohorte de femmes enceintes et non enceintes, ainsi que la nouvelle quantification relative du proNGF utilisant la même méthodologie dans un test duplex. format. L'adaptation du test à un format duplex a permis de mesurer les deux protéines en une seule fois, car le test IA-LC–MS/MS ne nécessite qu'un seul réactif d'anticorps de capture. Les niveaux basaux de tNGF sérique mesurés dans le sérum de contrôle étaient comparables aux niveaux précédemment trouvés via IA-LC-MS/MS55, et, bien que des tests de liaison de ligand à sensibilité plus élevée pour le NGF soient utilisés, ils sont restés mesurables à une sensibilité dix fois supérieure à certains précédemment publiés. Études ELISA58.

Ici, nous démontrons que les niveaux moyens de tNGF ne changent pas de manière significative entre le contrôle non enceinte et le premier trimestre. Cependant, les niveaux ont augmenté du premier trimestre au deuxième, et encore quoique plus modestement du deuxième au troisième (1,5 fois et 1,1 fois respectivement) mais avec une signification statistique basée sur la valeur p (Fig. 3). L'augmentation globale moyenne à partir du dernier trimestre de la grossesse par rapport au groupe témoin non enceinte était de 1,7 fois et était significative, sur la base des valeurs de p. Cette augmentation était supérieure à la variabilité observée établie lors de la qualification du dosage. Des études antérieures ont montré de petits changements non significatifs dans les niveaux circulants de NGF mature pendant la gestation humaine59,60 et bien que les données contenues dans cette étude montrent une augmentation faible mais significative du tNGF au cours de la gestation, elles sont en accord général avec les valeurs publiées précédemment48, 59.

Sur la base des valeurs p, les niveaux de proNGF n'ont pas changé de manière significative au cours de la gestation. Il a été démontré que les niveaux de proNGF circulant (ou dérivés clivés) sont mesurables par ELISA et varient en fonction des conditions de la maladie, bien que la caractérisation bioanalytique du test ait fait défaut61. Auparavant, il a été démontré que les niveaux de proNGF augmentaient pendant la gestation dans les tissus de l'utérus murin, mais comme cela a été observé avec la variation interspécifique des niveaux de NGF, il peut être difficile de comparer les niveaux de proNGF en termes de valeurs circulantes absolues entre les espèces45. Les niveaux de proNGF n'ont certainement pas augmenté pendant la grossesse humaine comme cela a été observé chez les rats45, soulignant la différence générale potentielle dans le rôle du proNGF dans la grossesse entre les espèces. Cependant, cela met également en évidence la nécessité d'utiliser des tests soigneusement qualifiés pour affirmer que les changements observés dans les niveaux de NGF ou de proNGF matures ne sont pas confondus par des problèmes bioanalytiques.

Ici, nous établissons une méthode LC-MS/MS sensible et sélective pour la détection du tNGF et du proNGF qui peuvent être mesurés simultanément, ce qui fournit une spécificité à la mesure de ces neurotrophines dans leurs divers rôles de biomarqueurs dans la gestation, le développement du système nerveux et la maladie états par rapport aux technologies actuellement utilisées.

Le facteur de croissance du nerf β humain recombinant lyophilisé (rhβ-NGF) (Catalogue # 256-GF-100; R&D Systems, Minneapolis, MN) a été préparé dans de l'albumine de sérum bovin à 0,2 % (Catalogue # Millipore-Sigma, Burlington, MA) dans 10 Solution saline tamponnée au phosphate mM, pH 7,4. Des lots de sérum humain provenant de BioIVT ont été regroupés (Various ; Westbury, NY). Les peptides marqués aux isotopes stables NGF- H2N-AWRFIRIDTACVCV[+7 Da]L[+6 Da]SRKAVRRA-OH (New England Peptides, Gardner, MA) et proNGF—H2N-LRSPRVLFSTQPPR[+10 Da]EAADT-OH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) ont été quantifiés par analyse des acides aminés, stockés à 5 nmol/mL à -80 °C et utilisés pour générer la solution de stock de peptide standard interne à des concentrations de 6,67 et 1,67 pmol/µL, respectivement, et encore dilués à 0,90 et 0,23 fmol/µL respectivement. L'anticorps anti-β-NGF polyclonal de chèvre (n° de catalogue AF-256 R&D Systems, Minneapolis, MN) a été biotinylé à l'aide de la biotine EZ-link Sulfo-NHS-LC (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific ; Rockford, IL) dans du PBS. L'anticorps polyclonal de lapin purifié par affinité de ligand contre le peptide trypsique dérivé du NGF IDTACVCVLSR a été obtenu auprès de New England Peptide (Gardner, MA), et l'anticorps polyclonal de lapin purifié par affinité du ligand proNGF contre le peptide trypsique dérivé du proNGF VLFSTQPPR a été obtenu auprès de ThermoFisher Scientific (Waltham , MA). Des colonnes d'anticorps antipeptides ont été préparées comme indiqué précédemment avec les anticorps (environ 1,0 mg par peptide) conjugués à la protéine-G (Poros-G Applied Biosystems, Bedford, MA) à l'aide de pimélimidate de diméthyle (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific ; Rockford, IL) pour la réticulation. La matrice de substitution (solution de lait à 1 %) a été préparée en dissolvant 0,5 g de lait en poudre dans 50 ml d'eau stérile Milli-Q et diluée davantage en solutions de travail dans la matrice de substitution.

Une matrice de substitution dans de l'eau Milli-Q stérile a été préparée. Le sérum humain a été utilisé comme QC pour le NGF et le proNGF QC low. Précédemment analysés, des lots regroupés de sérum humain provenant de BioIVT ont été utilisés comme proNGF QC high ainsi que dans le schéma de mélange proNGF QC décrit ci-dessus.

Une aliquote de 200 μl de sérum, d'étalons ou d'échantillon de contrôle qualité (CQ) a été ajoutée à une plaque à puits profonds Eppendorf LoBind, après dilution avec 650 μl de BSA à 0,5 % dans du PBS 10 mM. 10 μL d'anticorps anti-NGF biotinylé ont été ajoutés à chaque échantillon et la plaque a été scellée et agitée à 4 °C pendant une nuit (550 tr/min). Les Dynabeads Streptavidin MyOne C1 ont été remises en suspension et lavées une fois avec du Tween 20 à 0,05 % dans du PBS. 25 μL de billes C1 ont été ajoutés à chaque échantillon et laissés incuber à température ambiante pendant 45 min sous agitation (1000 tr/min). Les échantillons ont ensuite été placés sur le Hamilton Star pour le traitement des billes. L'échantillon et les billes remises en suspension ont été transférés dans une plaque de collecte Protein Lobind de 0,5 ml en 5 transferts de 300 µl (y compris le lavage/transfert final). Au cours de chaque transfert, les échantillons ont été laissés reposer sur un support magnétique pendant 4 minutes et le surnageant a été aspiré pour les déchets. Deux lavages séquentiels avec 300 µL de CHAPS à 0,1 % dans du PBS et un lavage final avec 300 µL de PBS 10 mM ont été effectués, les échantillons étant laissés au repos sur un support magnétique pendant 4 min et le surnageant aspiré dans les déchets. Les protéines ont été éluées avec 140 µL de HCl 30 mM dans de l'ACN à 5 % dans de l'eau, mélangées pendant 5 min, reposées sur un support magnétique pendant 5 min, et le surnageant a été transféré dans la plaque de collecte finale et neutralisé avec 35 µL de TRIS 1 M, pH 8,3. Dix µL de solution de travail d'étalon interne ont été ajoutés à chaque puits. Le bilan final comprenait l'ajout de 15 µL de solution réductrice de TCEP 75 mM (préparé frais avant l'ajout) et l'incubation à 60 °C pendant environ 45 min. La plaque a été laissée refroidir à température ambiante pendant environ 10 min ; et 15 µL d'IAA 150 mM ont été ajoutés à chaque puits d'échantillon et incubés dans l'obscurité à température ambiante pendant environ 35 min. Enfin, la digestion de l'échantillon a été effectuée avec 10 µL de solution de LysC/Trypsine à 100 µg/mL à 37 °C pendant la nuit.

85 µL ont été injectés sur un système HPLC contenant une colonne d'anticorps anti-peptide pour enrichir les peptides tryptiques d'intérêt avant la chromatographie à nanoflux en phase inverse composée d'Ultimate 3000 (ThermoFisher Scientific) avec les modules suivants : WPS-3000RS Échantillonneur automatique à température contrôlée équipé d'un Boucle d'échantillon de 250 µL ; Pompe binaire à séparation rapide HPG-3400RS (micro-pompe); Système NCS-3500RS Nano LC (pompe de chargement et pompe Nano); four à colonne TCC-3200RS (colonne d'anticorps); Four à colonne NCS 3500 RSC qui renferme les vannes 2, 3 et la colonne piège (Thermo µ-Precolumn Cartridge P/N 164649) équipé d'un Acclaim PepMap100 C18, 5 µm, 100 Å 300 µm id × 5 mm (60 °C). Le LC a été connecté à un triple quadripôle Thermo Quantiva avec une source d'ionisation Thermo Fisher Easy Spray. La colonne analytique est Thermo Easy Spray PepMap C18, 75 µm × 15 cm (p/n ES800) (60 °C). Les transitions MRM surveillées dans le test LC-MS/MS pour les deux protéines peuvent être trouvées dans le tableau S5.

Le dosage a été calibré avec des étalons à 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320 et 640 pg/mL de NGF dans du lait à 1 % (n = 2). Les concentrations de NGF dans les échantillons QC ou les inconnues ont été rétrocalculées dans TraceFinder 4.1 General Quan à l'aide d'une analyse de régression linéaire (pondérée : 1/ × 2) appliquée à la courbe d'étalonnage. La précision et l'exactitude de l'analyse du tNGF ont été testées sur 3 jours différents à quatre niveaux et avec six répétitions en utilisant QC1 (0,5 × endogène), QC2 (niveaux de tNGF endogène, sans dopage), QC3 (endogène + 45 pg/mL NGF) et QC4 (endogène + 450 pg/mL NGF). Une évaluation de la stabilité a été réalisée sur 1 cycle de congélation-décongélation pour QC3 et QC4 à − 70 °C (n = 6) ; et à température ambiante pendant 4 h aux niveaux de QC3 et QC4 (n = 6).

Pour l'évaluation analytique de la cohorte de grossesses ; quatre répliques de chaque standard d'étalonnage ont été réparties sur les deux plaques à 96 puits et les échantillons de contrôle qualité aux niveaux de QC2 ; QC3 et QC4 ont été répartis sur les deux plaques avec un n de 8 pour chaque niveau (n de 4 sur chaque plaque).

Une approche de quantification relative pour le proNGF a été utilisée qui n'incluait pas l'utilisation d'une norme d'étalonnage. Au lieu de cela, un schéma de mélange d'annonces a été conçu pour mesurer des lots de sérum humain qui étaient élevés (proQCH) et faibles (proQCL) pour le proNGF. Le sérum Millipore-Sigma a été utilisé pour le proQCL et le proQCH a été fabriqué en combinant des lots de sérum BioIVT qui ont été déterminés séparément comme ayant des niveaux élevés de proNGF. Les trois niveaux moyens de CQ ont été réalisés en mélangeant le proQCL et le proQCH à différents ratios : proQCM1 : 75 % de proQCL et 25 % de proQCH ; proQCM2 50 % proQCL et 50 % proQCH ; proQCM3 25 % proQCL et 75 % proQCH. La mesure du proNGF a été effectuée en établissant le rapport de la zone de signal du peptide léger à celle du peptide lourd (marqué avec un isotope stable).

Il y avait quatre cohortes dans cette étude comprenant des femmes enceintes fournissant un échantillon sur trois trimestres (groupe I : premier trimestre, semaines 1 à 13, n = 24 ; groupe II : deuxième trimestre, semaines 14 à 26, n = 28 ; groupe III : troisième trimestre, semaines 27 à 40, n = 22) avec des échantillons prélevés vers le milieu de chaque trimestre et les échantillons témoins (groupe IV : non enceinte, n = 29). La cohorte témoin non enceinte a été choisie pour correspondre le plus possible aux cohortes de grossesse. Les membres des cohortes de grossesse sont d'origine caucasienne, > 18 ans, avec une grossesse confirmée par test HCG et/ou échographie. Les échantillons proviennent d'une cohorte distincte de femmes à chaque étape de la grossesse. Les sujets ont été exclus s'ils avaient des antécédents de consommation de drogues illicites, des infections actuelles telles que le VIH, le zika, des maladies sexuellement transmissibles transmissibles par le sang, la drépanocytose ou toute autre maladie connue pouvant avoir un impact physiologique sur l'étude. Les infections antérieures à l'hépatite B/C, au VIH-1, au VIH-2, à la syphilis et à la tuberculose ont également été exclues. Les informations sur l'issue de la grossesse, telles que naissance vivante, singleton ou jumeaux, n'étaient pas disponibles. Le sérum a été collecté par Cureline, Inc. (Brisbane, CA USA) avec l'approbation éthique obtenue du WCG Institutional Review Board (WCG IRB Reference No.: 20140236; Cureline Study No. 1144700). Cet IRB est entièrement conforme aux bonnes pratiques cliniques telles que définies par les réglementations de la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, les réglementations du département américain de la santé et des services sociaux (HHS) et les directives de la conférence internationale sur l'harmonisation (ICH). Les participants ont fourni leur consentement éclairé écrit que leurs échantillons peuvent être utilisés dans la recherche biomédicale. Toutes les méthodes d'analyse ont été réalisées conformément aux directives et aux meilleures pratiques pertinentes de Pfizer.

Les concentrations de tNGF chez les sujets sains sériques ont été précédemment déterminées comme ayant un coefficient de variation d'environ 30 %55. Par conséquent, cette étude a été conçue et alimentée pour détecter une différence de concentration de tNGF de 25 à 30 % entre deux groupes : nécessitant une taille d'échantillon d'environ 20 à 25 par groupe à une puissance de 80 %. Des analyses statistiques ont été effectuées pour comparer les deuxième et troisième trimestres avec le premier, ainsi que les tendances linéaires à la fois entre les semestres et les quatre groupes. La transformation logarithmique a été appliquée au tNGF pour stabiliser sa variabilité entre les groupes avant l'analyse statistique. L'effet de la grossesse a été analysé dans un modèle d'analyse de variance à une voie (ANOVA). Les covariables potentielles ont été examinées et ajustées si elles étaient significativement associées au tNGF ou au proNGF. Les comparaisons entre les différents trimestres et les femmes non enceintes ainsi que la tendance linéaire entre les trimestres ont été testées à l'aide de contrastes dans le cadre du modèle ANOVA. Aucun ajustement pour les comparaisons multiples n'a été nécessaire et la signification statistique a été atteinte lorsque les valeurs de p étaient inférieures à 0,05 (voir Fig. 3). Toutes les analyses ont été effectuées dans R 3.5.0.

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche a été parrainée par Pfizer Inc. Cureline Inc., a fourni la cohorte d'échantillons de grossesse pour analyse.

Pfizer Inc., 1 Burtt Road, Andover, MA, 01810, États-Unis

Jason Walsh, Joe Palandra et Hendrik Neubert

Pfizer Inc., 1 Portland St, Cambridge, MA, 02139, États-Unis

Edouard Goihberg

Pfizer Inc., 10777 Science Center Drive, San Diego, Californie, 92121, États-Unis

Shibing Deng

Pfizer Inc., 445 Eastern Point Road, Groton, CT, 06340, États-Unis

Susan Hurst

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Conception et concept de l'étude : JW, JP, HN, SH Essai effectué et autres recherches : JW, JP, EG Analyse et interprétation des données : JW, JP, HN, SH, SD Rédaction du manuscrit : tous les auteurs. Revue et révision du contenu du manuscrit : Tous les auteurs.

Correspondance avec Jason Walsh.

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents suivants : Tous les auteurs sont, ou au moment où ces études ont été menées, étaient des employés de Pfizer Inc.

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Réimpressions et autorisations

Walsh, J., Palandra, J., Goihberg, E. et al. Analyse du facteur de croissance du nerf β et de son précurseur au cours de la grossesse humaine par spectrométrie de masse en tandem immunoaffinité-chromatographie liquide. Sci Rep 13, 9180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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Reçu : 14 décembre 2022

Accepté : 05 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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