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Aug 06, 2023

H2O2 endommage sélectivement le fer binucléaire

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7652 (2023) Citer cet article

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La NADH:ubiquinone oxydoréductase, complexe respiratoire I, joue un rôle majeur dans le métabolisme énergétique cellulaire en couplant transfert d'électron et translocation de proton. Le transfert d'électrons est catalysé par un mononucléotide de flavine et une série d'amas de fer-soufre (Fe/S). En tant que sous-produit de la réaction, la flavine réduite génère des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Il a été suggéré que les ROS générés par la chaîne respiratoire en général pourraient endommager les clusters Fe/S du complexe. Ici, nous montrons que le cluster binucléaire Fe/S N1b est spécifiquement endommagé par H2O2, mais seulement à des concentrations élevées. Mais dans les mêmes conditions, l'activité du complexe n'est guère affectée, puisque N1b peut être facilement contourné lors du transfert d'électrons.

Conversion d'énergie NADH:ubiquinone oxydoréductase, complexe respiratoire I, joue un rôle important dans la bioénergétique cellulaire en couplant l'oxydation du NADH et la réduction de l'ubiquinone (Q) avec la translocation des protons à travers la membrane1,2,3,4,5,6. Il est constitué d'un bras périphérique catalysant le transfert d'électrons et d'un bras membranaire responsable de la translocation des protons. Les deux bras sont disposés presque perpendiculairement l'un à l'autre, ce qui donne une structure en forme de L du complexe. Le complexe mitochondrial I se compose de 45 sous-unités dont 14 sous-unités centrales que l'on trouve chez toutes les espèces contenant une NADH:Q oxydoréductase à conversion d'énergie7,8. La structure tridimensionnelle des sous-unités centrales du complexe I est conservée des bactéries aux mammifères9,10. Le complexe bactérien d'Escherichia coli est composé de 13 sous-unités différentes nommées NuoA à NuoN, dont deux sont fusionnées à la seule sous-unité NuoCD11. Ils sont codés par les nuo-gènes et totalisent une masse moléculaire d'environ 530 kDa12.

Le NADH est oxydé à l'extrémité du bras périphérique par transfert d'hydrure vers l'accepteur d'électrons primaire flavine mononucléotide (FMN)13. De là, les électrons sont transférés sur une distance d'environ 100 Å via une série de sept amas de fer-soufre (Fe/S) vers la membrane, où Q est réduit et protoné dans une cavité de liaison spécifique composée de sous-unités du périphérique et le bras membranaire1,2,3,4,5,6. On pense que les espèces AQ se déplacent d'un site de liaison à haute énergie vers un site de liaison à basse énergie à l'intérieur de la cavité, provoquant des changements électrostatiques et conformationnels qui entraînent la translocation des protons dans le bras membranaire2,14,15,16. Le bras membranaire contient quatre voies putatives de protons qui sont reliées les unes aux autres et à la cavité Q par un axe central de résidus chargés. Il a été proposé que le mouvement de l'espèce Q dans sa cavité induit la propagation d'une onde « électrique » qui va et vient à travers le bras membranaire déclenchant la translocation du proton16. Alternativement, il a été suggéré que la liaison de la quinone conduit à une transition d'un état « ouvert » à un état « fermé »10. La réduction des quinones entraîne une redistribution des protons dans le bras membranaire, qui à son tour conduit à une libération de protons dans le cytoplasme exclusivement dans NuoL10.

L'oxydation du NADH par le complexe I est associée à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) telles que le superoxyde et le peroxyde d'hydrogène17,18,19,20 contribuant au stress cellulaire21. Il est généralement admis que les ROS générés par le complexe I proviennent du FMN17,18,19,20 réduit. Environ 0,1 à 2 % du NADH oxydé conduit à la production de ROS in vitro22,23,24,25. Les ROS contribuent non seulement aux dommages oxydatifs tels que la peroxydation des lipides, la dégradation des protéines et l'oxydation de l'ADN, mais représentent également des signaux redox essentiels26,27,28,29.

Le cofacteur FMN producteur de ROS est situé à proximité immédiate des amas Fe/S du complexe respiratoire I. Il est bien connu que les amas Fe/S exposés aux solvants sont sujets aux dommages oxydatifs30,31. Les structures du complexe I de différents organismes montrent que ses amas Fe/S sont principalement protégés du solvant et doivent donc être protégés de la dégradation par les ROS7,8,9,10,32,33,34,35,36. Néanmoins, il a été proposé qu'une production accrue de ROS par le complexe I et la chaîne respiratoire en général puisse endommager les amas Fe/S du complexe I37. Ici, nous avons utilisé le complexe E. coli I pour tester cette proposition. En représentant une forme structurelle minimale du complexe mitochondrial I, celui d'E. coli est dépourvu des sous-unités accessoires supplémentaires entourant le noyau catalytique. Par conséquent, les clusters Fe/S du complexe E. coli I pourraient être plus sensibles aux dommages oxydatifs que leurs homologues du complexe mitochondrial I. Puisqu'il est connu que le complexe E. coli I produit des ROS principalement sous forme de H2O238,39, nous ont testé l'influence de H2O2 sur l'activité du complexe I et sa composition en cluster Fe/S. Il s'est avéré que des concentrations millimolaires de H2O2 sont nécessaires pour inhiber l'activité de la NADH oxydase. Alors que l'activité NADH:décyl-ubiquinone du complexe isolé reste inchangée en présence de 1 mM H2O2, nous démontrons directement à l'aide de la spectroscopie RPE que le traitement avec 1 mM H2O2 entraîne une perte sélective du cluster Fe/S N1b sur la sous-unité NuoG.

En raison de l'activité des catalases cellulaires et des peroxydases, la concentration de H2O2 dans le cytoplasme d'E. coli se situe dans la gamme nanomolaire basse40,41. Cependant, l'ajout de H2O2 exogène peut augmenter la concentration intracellulaire intermédiaire jusqu'à la gamme micromolaire42. Ainsi, l'effet des concentrations micromolaires de H2O2 sur l'oxydation du NADH médiée par le complexe I a été mesuré initialement avec la protéine dans les membranes. Les membranes cytoplasmiques de la souche BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis ont été obtenues par centrifugation différentielle. En raison de l'absence de la NADH déshydrogénase alternative (ndh) et de la perturbation du nuo-opéron chromosomique, toutes les activités dérivées du NADH des membranes de cette souche reflètent exclusivement les activités du complexe de type sauvage I codé sur le plasmide.

L'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase du complexe I est catalysée par le FMN lié à NuoF et n'implique pas la participation de clusters Fe/S. De plus, cette activité n'est pas couplée à une translocation de protons. Il s'est avéré que les concentrations micromolaires de H2O2 n'avaient aucun effet sur cette activité. Seules des concentrations millimolaires ont exercé un effet significatif sur l'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase (Fig. 1A). Le titrage avec jusqu'à 20 mM de H2O2 a entraîné une inhibition de 55 % de l'activité avec une CI50 apparente de 14,4 mM.

Inhibition du complexe I par H2O2. (A) Activité NADH/ferricyanure oxydoréductase des membranes de la souche BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis. 100% d'activité correspond à 1,4 U mg-1. (B) Activité NADH oxydase des membranes de la souche BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis. 100% d'activité correspond à 0,27 U mg-1. (C) Activité NADH:décyl-ubiquinone oxydoréductase du complexe isolé I. 100% d'activité correspond à 21,9 U mg-1. Les lignes rouges à travers les points de données sont incluses uniquement à titre indicatif. Chaque point de données est la moyenne de trois répétitions techniques de deux échantillons biologiques. Les barres représentent le SEM à chaque point de données.

Pour doser l'effet de H2O2 sur l'activité physiologique du complexe I, y compris le transfert d'électrons via les clusters Fe/S vers Q, son influence sur l'activité NADH oxydase a été déterminée (Fig. 1B). Comme déjà observé pour l'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase, H2O2 n'inhibe l'activité NADH oxydase que dans la gamme millimolaire. Le titrage avec jusqu'à 20 mM de H2O2 a entraîné une inhibition d'environ 55 % de l'activité avec une CI50 apparente de 13,5 mM. La similitude des deux courbes d'inhibition suggère un effet non spécifique de H2O2 sur le complexe I dans la membrane.

Pour déterminer si l'inhibition est réversible, une aliquote non traitée de membranes et une aliquote traitée avec 20 mM de H2O2 ont été centrifugées trois fois et chacune a été remise en suspension dans du tampon A sans H2O2. L'activité NADH/ferricyanure et NADH oxydase de l'échantillon traité était de 50 ± 5 % de celle de l'échantillon non traité dans les deux cas. Ceci suggère que l'inhibition par H2O2 est irréversible.

Pour étudier spécifiquement l'effet de H2O2 sur le complexe I, la protéine a été isolée en présence du détergent LMNG (voir Fig. S1 supplémentaire) et l'inhibition de l'activité NADH:décyl-Q oxydoréductase de la préparation par H2O2 a été mesurée. Dans la plage allant jusqu'à 1,25 mM de H2O2, aucun effet sur l'activité du complexe I n'était détectable (Fig. 1C). Une addition de H2O2 20 mM a entraîné une inhibition de 65 % de l'activité. En résumé, nos expériences démontrent qu'aux concentrations observées dans des conditions physiologiques, H2O2 n'a aucun effet sur l'activité du complexe I.

Pour déterminer si H2O2 est néanmoins capable d'endommager les clusters Fe/S du complexe, une préparation a été divisée en aliquotes et les échantillons ont été soit traités avec un tampon, soit avec un volume égal de H2O2 à différentes concentrations. Les échantillons ont été réduits par un excès molaire de 2000 fois de NADH, incubés avec H2O2 pendant une minute à température ambiante puis congelés dans une solution réfrigérante à 150 K. Les spectres RPE ont été enregistrés à 40 K et 2 mW de puissance micro-onde pour détecter les deux binucléaires Amas Fe/S du complexe I, N1a et N1b. De plus, des spectres ont été enregistrés à 13 K et 5 mW pour détecter les amas tétranucléaires N2, N3 et N4. Les autres clusters Fe/S du complexe ne sont pas détectables par EPR43. L'échantillon fourni uniquement avec le tampon a été utilisé comme référence. Les échantillons qui ont d'abord été traités avec H2O2 puis réduits par NADH ont donné des spectres EPR similaires. L'incubation des échantillons avec H2O2 pendant 30 minutes avant ou après la réduction par le NADH n'a pas entraîné de changements spectraux.

Le spectre de l'échantillon de référence obtenu à 40 K et 2 mW de puissance micro-onde a montré la présence des amas binucléaires N1a (gx,y,z = 1,92, 1,94 et 2,00) et N1b (g//,⊥ = 2,03 et 1,94 ; figure 2a). Les signaux des amas tétranucléaires Fe/S N2 (g//,⊥ = 1,91 et 2,05), N3 (gx,y,z = 1,88, 1,92 et 2,04) et N4 (gx,y,z = 1,89, 1,93 , et 2,09) étaient présents dans le spectre enregistré à 13 K et 5 mW de puissance micro-onde en plus des signaux des amas binucléaires (Fig. 2d).

Spectres RPE du complexe E. coli I isolé à diverses concentrations de H2O2. Les spectres ont été enregistrés à partir d'un échantillon non traité (a,d), une aliquote incubée avec 100 µM (b,e) et 1 mM (c,f) H2O2. Les spectres ont été enregistrés à une puissance micro-onde de 40 K et 2 mW (rangée de gauche, a–c) pour détecter les amas binucléaires Fe/S et à une puissance de 13 K et 5 mW (rangée de droite, d–f) pour détecter en plus le tétranucléaire Fe/ Grappes S. Les signaux individuels sont attribués aux clusters Fe/S distincts selon59. La g-région centrale autour de g = 1,94 est perturbée dans (f) en raison de l'absence de g⊥ de N1b à 1,94.

Les spectres RPE des échantillons qui ont été incubés avec jusqu'à 100 µM de H2O2 n'ont montré aucun changement spectral significatif (Fig. 2b, e). Cependant, l'échantillon traité avec 1 mM H2O2 a clairement montré une perte drastique et spécifique du cluster N1b (Fig. 2c, f). La différence du spectre de l'échantillon non traité obtenu à 40 K moins celui de l'échantillon traité avec 1 mM H2O2 montre clairement les signaux du cluster N1b (voir Fig. S2 supplémentaire). Ainsi, la proportion de N1a n'a pas changé, car son signal serait autrement également détectable dans le spectre de différence. Cependant, une oxydation complète de N1b ne peut pas être déduite du spectre de différence. La perte du cluster N1b est également observée dans les spectres enregistrés à 13 K et 5 mW de puissance micro-ondes (Fig. 2c, f). Ici, une quantité résiduelle de N1b est toujours détectable dans les spectres enregistrés à 13 K (Fig. 2f) suggérant que l'amas n'est pas complètement endommagé. La double intégration du signal N1b à g = 2,03 qui n'a pas de chevauchement avec d'autres signaux a montré que 68% de N1b sont endommagés par 1 mM H2O2. Cependant, la quantité du cluster binucléaire N1a et des clusters tétranucléaires N2, N3 et N4 n'a pas changé même en présence de 50 mM H2O2. Ainsi, 1 mM H2O2 conduit à un dommage spécifique du cluster binucléaire N1b, alors que même les concentrations les plus élevées de H2O2 dans nos dosages n'ont aucun effet sur les autres clusters Fe/S du complexe I.

Pour distinguer si le cluster N1b est simplement oxydé ou "sur-oxydé" par H2O2, le complexe I a été incubé pendant 5 min avec 1 mM H2O2. Ensuite, l'excès de H2O2 a été éliminé par concentration et dilution répétées. L'échantillon a été réduit avec du NADH et le spectre EPR montre l'absence de cluster N1b (voir Fig. S3 supplémentaire). Ainsi, N1b est irréversiblement endommagé par H2O2 et non simplement oxydé.

La structure du complexe de diverses espèces montre que les centres Fe/S ne sont pas exposés au solvant. Pour savoir pourquoi N1b peut néanmoins être attaqué par H2O2, nous avons examiné de plus près la structure cryo-EM du bras périphérique du complexe E. coli qui contient tous les clusters Fe/S44. N1b est coordonné par quatre résidus cystéine d'un pli de ferrédoxine [2Fe – 2S] typique à la partie N-terminale de NuoG (Fig. 3). Ce domaine connecte NuoE et NuoF avec NuoG. Le cluster N1b est localisé à environ 5 Å de distance de la surface de NuoG mais sans accès direct au solvant (Fig. 3). Nous avons utilisé le programme CAVER pour identifier les canaux de solvant possibles qui pourraient conduire de la surface de la protéine au cluster. Un canal d'un diamètre de 2,28 Å mène du solvant au cluster (Fig. 3A). Le canal est flanqué des résidus Gly45G, Arg46G et Met67G (l'exposant fait référence au nom de la sous-unité du complexe E. coli I). Le complexe mitochondrial I contient plusieurs sous-unités accessoires, dont le nombre dépend de l'organisme particulier. Cependant, aucune de ces sous-unités accessoires ne protège davantage le cluster N1b vers le solvant. À titre d'exemple, l'environnement du cluster N1b du complexe I des mitochondries ovines36 est représenté sur la figure 3B. Dans le complexe mitochondrial I, N1b est positionné à environ 8,2 Å sous la surface de la protéine. Ici, le canal a un diamètre légèrement plus petit de 2,26 Å et s'étend sur une plus longue distance en forme de U (Fig. 3B). Cela est dû à la présence de Leu225 de la sous-unité NDUFV1, l'homologue d'E. coli NuoF, et d'Arg53 de NDUFS1, l'homologue d'E. coli NuoG, qui bloquent tous deux le chemin direct vers le cluster. Dans le complexe ovin I, le chemin est en outre contrôlé par les résidus Gly50, Arg53, Ala67 et Ala70 de NDUFS1 et Tyr118 de la sous-unité NDUFS4, une sous-unité accessoire qui est un homologue structurel d'un extra-domaine de NuoG44. Les canaux de solvant sont suffisamment grands dans les deux organismes pour permettre le passage de H2O2 vers le cluster. Certains des atomes de revêtement sont hydrophobes et entravent le passage rapide, mais sans le bloquer. Ainsi, un ajout de H2O2 conduirait vraisemblablement également à un dommage de N1b dans le complexe mitochondrial I.

Accessibilités de surface pour H2O2 des clusters N1a et N1b dans E. coli et O. aries. Les canaux de surface ont été sondés avec CAVER 3.0.3 sur les identifiants PDB 7AWT (E. coli) et 7ZD6 (O. aries). Les distances des atomes de revêtement aux centres des canaux aux constrictions sont fournies et en outre indiquées par des tirets. (A, B) Canaux de solvant menant vers N1b dans E. coli (A) et O. aries (B). Les diamètres fournis sont étroits, mais vraisemblablement suffisants pour permettre le passage de H2O2 vers N1b avec 2,28 Å dans E. coli et 2,26 Å dans O. aries. Notez que dans le complexe O. aries I, un accès direct au cluster est bloqué par R53 de NDUFS1. La distance linéaire de N1b à la surface accessible au solvant s'élève à 4,9 Å (E. coli) et 8,2 Å (O. aries), respectivement (non indiqué). (C, D) L'accessibilité H2O2 de N1a est limitée avec des diamètres de canal de 1,98 Å (E. coli) et 1,90 Å (O. aries). Les atomes apolaires aux constrictions repoussent efficacement les molécules polaires. La distance minimale des atomes de fer N1a à la surface est de 7,3 Å (E. coli) et 9,3 Å (O. aries), respectivement (non indiqué).

Il a déjà été rapporté que H2O2 n'a aucun effet sur l'activité du complexe I d'E. coli42. Cependant, aucune donnée n'a été montrée et il a seulement été mentionné que 5 mM H2O2 ne diminuent pas son activité. A partir de ces données, il a été conclu que H2O2 n'oxyde pas les clusters Fe/S du complexe I42. Ici, nous montrons que l'incubation des membranes d'E. coli avec 5 mM de H2O2 conduit à une inhibition faible mais significative de l'activité de la NADH oxydase, lorsque le complexe I est surproduit. L'inhibition semi-maximale est obtenue à 13,5 mM de H2O2 (Fig. 1B). L'inhibition de l'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase a montré une évolution d'activité similaire avec une IC50 de 14,4 mM H2O2 (Fig. 1A). Cependant, l'incubation de FMN et de NADH libres avec 20 mM de H2O2 n'entraîne pas leur modification chimique (voir Fig. S4 supplémentaire). À partir de là, nous proposons que la diminution des activités NADH oxydase et NADH / ferricyanure oxydoréductase à des concentrations élevées de H2O2 (Fig. 1A, B) est très probablement due à une oxydation non spécifique des protéines45.

Cependant, contrairement à l'hypothèse selon laquelle H2O2 n'a aucun effet sur l'amas Fe/S du complexe42, nous montrons expérimentalement par spectroscopie RPE que l'ajout de 1 mM H2O2 conduit à la dégradation oxydative de l'amas binucléaire N1b sur la sous-unité NuoG (Fig. . 2). Les calculs des taux de transfert d'électrons intramoléculaires ont révélé que le transfert d'électrons du cluster N3 à N4 via le cluster N1b peut facilement être contourné par un transfert direct d'électrons du cluster N3 à N4, tous deux situés sur NuoG (Fig. 4) 46,47. Dans ce cas, la flavine réduite transférera séquentiellement ses électrons au cluster N3 comme dans le complexe non traité. Ici, les électrons auront un arrêt transitoire séquentiel avant d'apparaître aux clusters N4 et N547. La distance bord à bord entre N3 et N4 est de 14,9 Å, ce qui conduit théoriquement à un taux de transfert d'électrons intramoléculaire global diminué de 10 fois46,47. Cela ne changera pas le taux de transfert d'électrons global de NADH à Q car la réduction et la libération de Q sont beaucoup plus lentes que le transfert d'électrons intra-moléculaire le long des clusters Fe/S43. Récemment, nous avons généré une variante du complexe I dépourvue du cluster N1b en supprimant la protéine porteuse du cluster fer-soufre E. coli BolA48. L'absence de cluster N1b a conduit à l'assemblage d'un complexe actif. Fait important, la perte de N1b n'a pas affecté l'activité NADH oxydase des membranes mutantes, ce qui signifie que l'absence de N1b n'a pas modifié le taux de transfert d'électrons global du NADH vers Q48.

Schéma montrant la disposition des clusters Fe/S dans le module d'entrée d'électrons du complexe E. coli I. Les positions relatives des clusters N1a (NuoE), N3 (NuoF) et N1b, N4 et N5 (tous NuoG) sont indiquées. Les flèches indiquent les voies de transfert d'électrons possibles. Les distances bord à bord entre les clusters en Å sont indiquées sur les flèches respectives. Le manque de N1b peut être contourné par transfert direct d'électrons de N3 à N4 (rouge ; nomenclature selon59).

Les dommages oxydatifs de N1b par H2O2 étaient inattendus car les clusters Fe/S du complexe I sont bien enfouis dans la protéine. Cependant, le canal court identifié avec le programme CAVER ouvre la voie à H2O2 de la surface de la protéine vers le cluster N1b dans le complexe bactérien et mitochondrial I (Fig. 3). En regardant la structure globale du complexe, il apparaît que le cluster N1a sur NuoE est le plus exposé au milieu aqueux (Fig. 3). En revanche, l'environnement protéique de N1a est plus hydrophobe que celui des autres clusters. En effet, CAVER a identifié un canal d'un diamètre de 1, 98 Å dans E. coli et de 1, 9 Å dans le complexe ovin I, respectivement (Fig. 3C, D) menant de la surface de la protéine directement à N1a. Remarquablement, cependant, ce canal est tapissé d'atomes apolaires aux constrictions respectives. Très probablement, cette surface hydrophobe du canal empêche également H2O2 d'endommager le cluster N1a.

Pris ensemble, nos données montrent clairement que les concentrations physiologiques de H2O2 n'endommagent pas les clusters Fe/S du complexe respiratoire I. De plus, des concentrations élevées endommagent spécifiquement le cluster N1b. Cependant, les dommages de N1b n'affectent pas l'activité du complexe I, car ce cluster peut être contourné lors du transfert d'électrons intramoléculaire, préservant ainsi l'activité physiologique du complexe.

Un dérivé de la souche E. coli BW2511349, dépourvue chromosomiquement du gène ndh, a été utilisé comme hôte pour surproduire le complexe I48. Le nuo-opéron chromosomique de cette souche a été remplacé par une cartouche de résistance (nptII). La souche hôte a été transformée avec le plasmide pBADnuoHis codant pour le nuo-opéron50 entier. L'expression du nuo-opéron a été induite par l'ajout de 0,2 % (p/v) de l-arabinose. Pour la préparation des protéines, les cellules ont été cultivées à 37 °C dans un milieu d'auto-induction riche contenant 34 µg/mL de chloramphénicol sous agitation à 180 tr/min51. Selon le montage expérimental, toutes les activités induites par le NADH des membranes de la souche transformée proviennent de l'activité catalytique du complexe I surproduit codé par le plasmide.

Les cellules ont été récoltées par centrifugation, mises en suspension dans 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, pH 6,0 (tampon A) contenant 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) et quelques grains de DNAsel et rompues par trois passages à travers un HPL-6 (Maximator, 1000–1500 bars)51. Les membranes cytoplasmiques ont été obtenues par centrifugation différentielle51 et mises en suspension dans un volume égal (1:1, p/v) de tampon A avec 5 mM MgCl2 et 0,1 mM PMSF.

Le complexe a été préparé comme décrit52. En bref, les protéines membranaires ont été extraites avec 2 % (p/v) de lauryl maltose néopentyl glycol (LMNG ; concentration finale), l'extrait clarifié a été ajusté à 20 mM d'imidazole et appliqué à une colonne ProBond Ni2+-IDA de 35 mL (Invitrogen) équilibrée dans le tampon A avec 5 mM de MgCl2, 10 % (v/v) de glycérol, 0,005 % (p/v) de LMNG et 20 mM d'imidazole à pH 6,8. Les protéines liées ont été éluées avec le même tampon contenant 308 mM d'imidazole. Les fractions contenant l'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase ont été regroupées, concentrées par ultrafiltration dans des filtres centrifuges MWCO Amicon Ultra-15 de 100 kDa (Millipore) et polies à l'aide d'une colonne de chromatographie d'exclusion de taille Superose 6 (300 ml, GE Healthcare) équilibrée dans le tampon A avec 5 mM MgCl2, 10 % (v/v) glycérol et 0,005 % (p/v) LMNG. Les fractions avec l'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase la plus élevée ont été utilisées pour d'autres études.

Les tests d'activité ont été effectués à 30°C. L'activité NADH oxydase des membranes cytoplasmiques a été déterminée avec une électrode à oxygène de type Clarke (DW1; Hansatech) comme décrit51. L'électrode a été calibrée en ajoutant quelques grains de dithionite de sodium à un tampon saturé d'air51. L'activité NADH/ferricyanure oxydoréductase a été déterminée comme une diminution de l'absorbance du ferricyanure à 410 nm avec un spectromètre à barrette de diodes (cuvette QS, d = 1 cm, Hellma ; TIDAS II, J&M Aalen) en utilisant un ε de 1 mM−1 cm− 153. Le dosage a été effectué dans du tampon A contenant du ferricyanure 1 mM et du NADH 0,2 mM. La réaction a été déclenchée par l'ajout de la protéine et la vitesse de la réaction enzymatique a été corrigée par la valeur de la réaction non enzymatique. L'activité NADH:décyl-Q oxydoréductase a été mesurée en tant que diminution de la concentration de NADH à 340 nm en utilisant un ε de 6,3 mM-1 cm-1 (cuvette QS, d = 1 cm, Hellma ; TIDAS II, J&M Aalen). Le complexe purifié I a été mélangé dans un rapport 1: 1 (p/p) avec des lipides polaires d'E. coli (10 mg mL-1; Avanti) et incubé sur de la glace pendant 30 min. Le dosage contenait 60 µM de décyl-Q, 2 µg de complexe I et un excès molaire décuplé (5 µg) de cytochrome bo3 oxydase d'E. coli dans le tampon A avec 5 mM de MgCl2, 10 % (v/v) de glycérol et 0,005 % (p/ v) LMNG. La réaction a été démarrée par une addition de 150 uM de NADH46. Différentes concentrations de H2O2 (30 %, v/v ; Chemsolute) ont été ajoutées aux dosages juste avant le début de la réaction.

Pour déterminer la réversibilité de l'inhibition de H2O2, les membranes ont été incubées pendant 5 min avec 20 mM de H2O2. Des aliquotes de membranes traitées et non traitées ont été centrifugées (178 000 g, 4 °C, 60 min, rotor 60Ti, Sorvall wX + ultra centrifugeuse, Thermo Scientific) et remises en suspension dans le tampon de volume dix fois A avec 5 mM MgCl2 et 0,1 mM PMSF. Cette procédure a été répétée deux fois et l'activité NADH/ferricyanure et NADH oxydase des deux échantillons a été déterminée.

Les mesures RPE ont été réalisées avec un spectromètre EMX 6/1 (Bruker) fonctionnant en bande X. La température de l'échantillon a été contrôlée avec un cryostat à flux d'hélium ESR-9 (Oxford Instruments). Les spectres ont été enregistrés à une puissance micro-onde de 40 K et 2 mW et à une puissance micro-onde de 13 K et 5 mW de 300 à 380 mT. Les autres conditions EPR étaient les suivantes : fréquence micro-onde, 9,360 GHz ; amplitude de modulation, 0,6 mT ; constante de temps, 0,164 s ; vitesse de balayage, 17,9 mT min-1. 300 µL de complexe I (2,5–3,5 mg mL−1) dans le tampon A ont été réduits avec un excès molaire de 2 000 fois NADH (10–14 mM) et congelés par choc à 150 K dans du 2-méthylbutane/méthylcyclohexane (1:5 ; v : v).

Pour déterminer si H2O2 oxyde ou endommage le cluster N1b, le complexe I a été incubé avec 1 mM H2O2 pendant 5 min. L'excès de H2O2 a été éliminé en concentrant l'échantillon par ultrafiltration (Amicon Ultra-15, MWCO : 100 kDa, Millipore ; 3 800 g, 4 °C, rotor A-4-44, centrifugeuse 5804R, Eppendorf) suivi d'une dilution au 10e dans le tampon A avec 5 mM de MgCl2, 10 % (v/v) de glycérol et 0,005 % (p/v) de LMNG. Cette procédure a été répétée deux fois. Un spectre RPE de l'échantillon concentré réduit par un excès molaire de NADH de 2000 fois a été enregistré.

L'accessibilité aux solvants des clusters Fe / S d'E. coli et du complexe ovin I a été sondée avec le plugin PyMOL CAVER (version 3.0.3) 54, 55 à des rayons minimaux de 0, 90 à 1, 20 Å en utilisant le modèle pdb 7AWT du bras périphérique contenant tous les clusters44 et le modèle pdb 7ZD6 du complexe ovin I36.

La concentration en protéines a été déterminée selon la méthode du biuret en utilisant la BSA comme étalon56. La concentration du complexe I purifié a été déterminée par spectroscopie UV/vis (TIDAS II, J&M Aalen) en utilisant un ε de 781 mM-1 cm-1 dérivé de la séquence d'acides aminés57. La SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium et de polyacrylamide) a été réalisée avec un gel de séparation à 10 % et un gel d'empilement à 3,9 %. Une éventuelle oxydation du FMN et du NADH par H2O2 a été dosée par analyse LC-MS. FMN 1 mM et NADH 1 mM (tous deux de Sigma Aldrich) dans le tampon A ont été incubés avec 20 mM H2O2 pendant 30 min à température ambiante, puis soumis à HPLC (ProntoSIL 120-3-C18 ; AQ plus ; 1 mL, 150 × 3,0 mm) à un débit de 0,5 mL min-1 dans 10 % d'acétate de triéthylammonium (100 mM) et 90 % d'eau. Après 1 min, un gradient de 10 à 90 % d'acétonitrile a été appliqué en 17 min. Les échantillons d'élution ont été directement analysés par API-MS (Dionex MSQ Plus).

Les données à l'appui des conclusions de cet article sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) par les subventions 278002225/RTG 2202 et SPP1927 ; FR 1140/11-2 à TF.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Institut de biochimie, Université Albert-Ludwigs de Fribourg, Albertstr. 21, 79104, Fribourg, Allemagne

Lisa Strotmann, Caroline Harter, Tatjana Gerasimova, Daniel Wohlwend & Thorsten Friedrich

Institut de chimie organique, Université Albert-Ludwigs de Fribourg, Albertstr. 21, 79104, Fribourg, Allemagne

Kevin Ritter et Henning J. Jessen

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LS, CH et TG ont purifié la protéine, LS a effectué les mesures d'activité et acquis les données, TF a enregistré les spectres EPR, DW a effectué les calculs, KR et HJJ ont enregistré les données LC-MS, tous les auteurs ont analysé les données. TF a écrit le manuscrit avec l'aide de tous les auteurs, TF a conçu l'étude.

Correspondance à Thorsten Friedrich.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Strotmann, L., Harter, C., Gerasimova, T. et al. H2O2 endommage sélectivement le cluster binucléaire fer-soufre N1b du complexe respiratoire I. Sci Rep 13, 7652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5

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Reçu : 08 février 2023

Accepté : 08 mai 2023

Publié: 11 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5

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