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Aug 08, 2023

Analyse structurale d'un endogène 4

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 552 (2023) Citer cet article

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Le complexe oxoglutarate déshydrogénase (OGDHc) participe au cycle de l'acide tricarboxylique et, dans une réaction en plusieurs étapes, décarboxyle l'α-cétoglutarate, transfère le succinyle en CoA et réduit le NAD+. En raison de son rôle central dans le métabolisme, les composants enzymatiques de l'OGDHc ont été étudiés isolément ; cependant, leurs interactions au sein de l'OGDHc endogène restent insaisissables. Ici, nous discernons l'organisation d'un OGDHc thermophile, eucaryote, natif dans son état actif. En combinant des méthodes biochimiques, biophysiques et bioinformatiques, nous résolvons sa composition, son architecture 3D et sa fonction moléculaire à une résolution de 3,35 Å. Nous rapportons en outre la structure cryo-EM haute résolution du noyau OGDHc (E2o), qui affiche diverses adaptations structurelles. Il s'agit notamment des modèles de liaisons hydrogène confinant les interactions des enzymes participant à l'OGDHc (E1o-E2o-E3), de l'effet tunnel électrostatique qui pilote la communication inter-sous-unités et de la présence d'une sous-unité flexible (E3BPo), reliant E2o et E3. Cette analyse multi-échelle d'un extrait cellulaire natif producteur de succinyl-CoA fournit un modèle pour les études structure-fonction de mélanges complexes de valeur médicale et biotechnologique.

Le complexe oxoglutarate déshydrogénase (OGDHc) est l'un des principaux régulateurs du flux métabolique dans le cycle tricarboxylique (TCA), ce qui signifie que les cellules maintiennent l'abondance et l'activité de l'OGDHc sous un contrôle strict1,2. Chez les eucaryotes, l'OGDHc est active dans la mitochondrie, mais une fraction du complexe se localise également dans le noyau réalisant la succinylation de la lysine des histones3. La réaction catalysée par l'OGDHc - la décarboxylation de l'oxoglutarate (α-cétoglutarate) en succinyl-CoA - est importante pour la production d'énergie, l'interaction métabolique entre les mitochondries et le cytoplasme ainsi que le métabolisme des neurotransmetteurs. En effet, l'oxoglutarate (α-cétoglutarate) est généré dans le cycle TCA lors de l'oxydation des glucides et des acides gras et par la glutamate déshydrogénase lors de la désamination oxydative du glutamate. Il est en outre produit par la transamination du glutamate dans le cadre de la navette malate-aspartate, qui transfère les équivalents réducteurs du cytoplasme aux mitochondries. Cette position cruciale de l'OGDHc dans le métabolisme et l'association entre la diminution de l'activité de l'OGDHc dans le cerveau et la neurodégénérescence ont stimulé des recherches approfondies4,5. De plus, l'OGDHc est très sensible aux espèces réactives de l'oxygène (ROS)6, et son éventuelle inhibition due au stress oxydatif pourrait s'avérer préjudiciable au métabolisme global d'une cellule. De telles conditions cellulaires associées au cancer peuvent avoir un impact sur l'activité de l'OGDHc7, d'autant plus que l'oxoglutarate est un effecteur de la suppression tumorale médiée par p538. Par conséquent, la compréhension des relations structure-fonction de l'OGDHc présente un intérêt particulier.

Au niveau moléculaire, l'OGDHc est un assemblage de la taille d'un mégadalton de multiples copies de trois enzymes, à savoir E1o (oxoglutarate déshydrogénase, EC 1.2.4.2), E2o (dihydrolipoyl succinyltransférase, EC 2.3.1.61) et E3 (dihydrolipoyl déshydrogénase, EC 1.8. 1.4). E2o forme le cœur du complexe avec une stoechiométrie stable de 24 copies dans un assemblage cubique, tandis que les protéines E1o et E3 s'assemblent à sa périphérie pour effectuer la réaction complète dans un métabolon d'ordre élevé encore stoechiométriquement et structurellement inconnu (Fig. 1A ). Bien que les composants enzymatiques uniques de l'OGDHc aient été structurellement résolus et que la caractérisation cinétique de ses étapes discrètes soit étudiée9, 10, 11 (Fig. 1B), leur intercommunication est inconnue, ce qui entrave par conséquent les études structure-fonction sous-jacentes à ce métabolon. En raison du défi de sonder sa structure et sa fonction endogènes, une analyse par spectrométrie de masse moderne combinée à une modélisation basée sur la réticulation a été récemment utilisée pour obtenir des informations sur la proximité des sous-unités de l'OGDHc à basse résolution sans sonder son activité12. Cela est dû au fait que le métabolon n'a pas encore été reconstitué in vitro en tant qu'entité fonctionnelle malgré des décennies de recherche. De plus, le domaine lipoyle (LD) qui transfère les intermédiaires lipoyle d'un site actif à l'autre (E1o → E2o → E3) fait partie d'un bras E2o très flexible, ce qui représente un défi particulier pour son étude par des méthodes structurales traditionnelles. L'implication potentielle d'éléments structurels supplémentaires, tels que des sous-unités qui pourraient contribuer à la communication croisée OGDHc, c'est-à-dire KGD413, complique davantage la caractérisation du complexe.

Une représentation schématique des connaissances antérieures sur l'architecture globale de l'OGDHc. Un noyau cubique composé de 24 protéines E2o, avec des lieurs flexibles étendus se terminant par le domaine LD ordonné, et des dimères E1o et E3 à la périphérie. B Schéma réactionnel complet de l'OGDHc. C Microscopie à lumière fluorescente de filaments isolés de C. thermophilum, avec la membrane cellulaire de couleur rouge, colorée au FM464. D Microscopie à lumière fluorescente d'un seul filament de C. thermophilum, avec la membrane cellulaire de couleur rouge, colorée au FM464. E Microscopie à lumière fluorescente d'un seul filament de C. thermophilum, avec le contenu mitochondrial très abondant visible en couleur verte, coloré avec MiOr. F Image en microscopie électronique à transmission de coupes ultra-minces cryo-fixées de filament de C. thermophilum. Avec "M", les mitochondries sont annotées dans l'image. G Zoom sur les ultrastructures des mitochondries visibles en F. Les christae en forme de ruban des mitochondries de C. thermophilum sont visibles (annotées "RLC").

Dans ce travail, nous nous efforçons d'élucider la structure du métabolon OGDHc dans le contexte d'une fraction de lysat native dérivée de Chaetomium thermophilum après un fractionnement en une seule étape du lysat brut (Fig. 1 supplémentaire). C. thermophilum est un champignon filamenteux thermophile avec une température de croissance optimale de 54 °C et la thermostabilité inhérente de ses protéines et complexes protéiques en fait un modèle idéal pour les études structurelles axées sur des cibles à plusieurs composants, telles que l'OGDHc ou d'autres complexes protéiques14 ,15,16. Les avantages inhérents à un extrait de cellule thermophile sont mis en avant tandis que nous disséquons sa composition et son architecture. Nous utilisons des tests biochimiques pour révéler les paramètres cinétiques du complexe pour la production de succinyl-CoA, identifier tous ses composants et utiliser la microscopie cryoélectronique, la réticulation et l'intelligence artificielle (IA) pour élucider la mégastructure du complexe à haute résolution avec une collecte de données rigoureuse. stratégies. Dans l'ensemble, nous fournissons un instantané à plusieurs échelles d'un extrait cellulaire enrichi en OGDHc qui est souligné par des régions flexibles dictant les interactions enzyme-enzyme transitoires, des grappes d'enzymes qui canalisent électrostatiquement les intermédiaires OGDHc et une architecture d'ordre supérieur de l'OGDHc critique pour l'ensemble du complexe. fonction.

Le champignon thermophile C. thermophilum a été cultivé à 54 ° C pendant 20 h avant de lyser et de fractionner par chromatographie d'exclusion de taille (SEC) 8 g de poids frais de cellules (Méthodes). Les hyphes de C. thermophilum (Fig. 1C – G) sont riches en mitochondries, comme validé par les méthodes de microscopie confocale et électronique (Fig. 1C – G). Les mitochondries présentent les crêtes lamellaires attendues en forme de ruban, formant des empilements parallèles en coupe transversale17 (Fig. 1F, G). Une forte abondance de mitochondries (Fig. 1F, G) est cohérente avec l'augmentation des taux respiratoires des thermophiles18 et nous a motivés à dériver un extrait cellulaire enrichi en activités mitochondriales dans lequel l'OGDHc fonctionnel se présente en grande abondance14 avec toutes ses sous-unités connues (E1o , E2o, E3)19. Ici, nous avons vérifié la présence de toutes les enzymes via Western Blotting (WB) (Fig. 2A, Fig. 2A supplémentaire) et procédé à la caractérisation quantitative des paramètres cinétiques pour tous les substrats solubles du métabolon, à savoir NAD +, α-cétoglutarate (α-KG ) et coenzyme-A (CoA). L'OGDHc catalyse la conversion de l'α-cétoglutarate (α-KG) en succinyl-CoA par une réaction en plusieurs étapes impliquant différents cofacteurs (Fig. 1B) : le diphosphate de thiamine (ThDP) se lie à l'E1o, un lipoate lié de manière covalente au domaine de liaison au lipoyle (LD) de l'E2o, tandis que FAD se lie à son site respectif à l'E3. E1o et E2o sont uniques pour ce complexe, mais E3 est partagé entre tous les complexes oxo-acide déshydrogénase. Les valeurs de KM en fraction ont été déterminées à [149,80 ± 41,78] μΜ, [146,11 ± 46,15] μΜ et [22,81 ± 11,93] μΜ respectivement (Fig. 2B, Fig. 2B supplémentaire, Données supplémentaires 1) et sont comparables à celles d'autres homologues thermophiles20,21. Pour afficher avec précision l'avantage d'un extrait cellulaire actif dérivé d'un eucaryote thermophile, nous avons répété la caractérisation et effectué une comparaison de la vitesse de réaction pour α-KG dans un gradient de température entre un C. thermophilum et un extrait équivalent de S. cerevisiae (Fig. .2C, Données supplémentaires 1). Les données dérivées affichent clairement une augmentation de la vitesse de réaction pour l'extrait cellulaire dérivé de C. thermophilum, contrairement à la diminution de la vitesse de l'échantillon équivalent de levure montrant l'aptitude à l'analyse structurelle de l'extrait cellulaire dérivé d'un organisme thermophile. À notre connaissance, la mesure des paramètres cinétiques pour tous les substrats d'OGDHc dans un seul échantillon endogène n'a pas été rapportée auparavant. Nos résultats constituent une référence pour les futures comparaisons fonctionnelles des complexes d'acides céto. Nos résultats démontrent également qu'une seule fraction cellulaire est cinétiquement active, évolutive en raison de sa nature biochimique et exploitable pour la formation de produits sans nécessiter de schémas de purification ou d'enrichissement supplémentaires. Il est important de noter qu'un tel extrait cellulaire actif peut être visualisé par cryo-EM pour approfondir la compréhension structurelle du complexe actif.

A Western blots affichant la détection de tous les composants OGDHc dans la fraction d'extrait de cellules natives au poids moléculaire attendu (MW). Une fraction de faible poids moléculaire a été utilisée comme contrôle négatif, tandis que la protéine surexprimée qui a été utilisée pour créer les anticorps a été utilisée comme contrôle positif. En raison de la grande taille de la protéine E1o, un fragment a été utilisé pour cette raison (voir Méthodes). Les bandes correspondantes ont été annotées avec une flèche orange. B Caractérisation enzymatique de l'OGDHc native. L'α-cétoglutarate, le NAD + et le CoA ont été utilisés aux concentrations indiquées dans chaque graphique en conséquence, la vitesse a été normalisée à 0-1 et une ligne relie chaque point, avec différents symboles annotant les points de données pour les trois répétitions biologiques indépendantes, comme annoté dans le panneau des figures. C Graphique affichant le changement de vitesse de réaction (après normalisation à 0-1) en fonction de la température pour C. thermophilum par rapport à un échantillon équivalent de levure, avec différents symboles annotant les points de données pour les trois répétitions biologiques indépendantes, comme indiqué dans le panneau de personnages. Les valeurs KM indiquées dans les tracés B et C ont été obtenues par les tracés Burk-Lineweaver illustrés dans la Fig. 2B supplémentaire et le fond gris pour chaque graphique et les barres noires en bas du graphique représentent l'écart type dérivé de N = 3 réplicats biologiques indépendants et 2 duplicatas techniques pour chaque répétition. Toutes les valeurs indiquées ici sont répertoriées dans les données supplémentaires 1.

Pour caractériser structurellement le métabolon OGDHc, nous avons effectué une acquisition intensive de données cryo-EM de l'extrait actif caractérisé. La structure déterminée pour le noyau E2o a atteint une résolution de 3, 35 Å (Fig. 3A supplémentaire, Tableau supplémentaire 1) permettant la construction de modèles de novo et améliorant considérablement la résolution par rapport à celle du noyau E2o signalé précédemment (Fig. 3B supplémentaire). La carte EM (Fig. 3A) affiche des caractéristiques structurelles d'ordre supérieur, par exemple des interfaces inter et intratrimériques (Fig. 3B), capture des éléments de structure secondaires et place avec précision les chaînes latérales d'acides aminés (Fig. 3C supplémentaire). Nous avons pu identifier le site actif catalytique de E2o et modéliser entièrement les conformations des chaînes latérales des acides aminés participant à la liaison CoA qui sont conservées à travers les déshydrogénases oxo-acides. F247 a une orientation vers l'extérieur pour accueillir le CoA (Fig. 3C), interagissant et stabilisant le groupe CoA 3',5'-adénosine diphosphate via un empilement π. La présence limitée de densité électronique pour les composants de l'acide pantoique CoA, de la β-alanine et de la cystéamine sous-tend la flexibilité inhérente de la coenzyme A liée de manière endogène avec des implications pour la fonction22.

A La carte cryo-EM de 3,35 Å (0,143 FSC) du noyau C. thermophilum OGDHc E2o. Barre d'échelle : 5 nm. B Le modèle reconstruit du noyau E2o de C. thermophilum, intégré dans la carte cryo-EM. En dessous, les interfaces inter- et intra-trimériques peuvent être observées isolément. C La région de liaison CoA de l'E2o, avec les chaînes latérales d'acides aminés annotées qui participent à sa coordination. De plus, la densité résolue dans la poche peut correspondre à un CoA lié. D Densité résolue à la périphérie du trimère du vertex E2o, appartenant éventuellement à un domaine lipoyle E2o lié.

Une autre densité est observée à proximité du site de liaison du lipoyle E2, et dans laquelle le domaine lipoyle (LD) de la région E2o N-ter peut s'insérer (Fig. 3D); Cette observation est conforme aux données publiées précédemment, où dans le complexe pyruvate déshydrogénase endogène bactérien (PDHc), qui forme également un noyau cubique - une caractéristique des complexes céto-acides à travers les royaumes - une densité équivalente a également été attribuée à la LD23. Un LD lié a également été structurellement raffiné dans le site actif PDHc E2 eucaryote dans une conformation similaire et stable24. Dans l'OGDHc eucaryote, natif et actif présenté ici, cette densité persiste, bien qu'à une résolution inférieure, et le LD peut être partiellement adapté (Fig. 3D). Une différence majeure réside dans le fait que, par rapport à la PDHc bactérienne, qui pourrait être piégée dans un état de repos proposé avec tous les LD liés aux sites actifs E2, la présente OGDHc eucaryote met en évidence un état de repos alternatif où les LD sont sous-stoechiométriques et transitoires. interagissant avec le noyau E2. Dans l'ensemble, cette structure de base OGDHc comprend la reconstruction de résolution la plus élevée signalée à ce jour pour un membre de la communauté protéique caractérisé dans des extraits de cellules natives. Outre les caractéristiques évidentes à haute résolution, les interfaces d'ordre supérieur et les sites actifs LD / CoA sont définis à haute résolution, tandis que, en raison de sa nature endogène, des densités à basse résolution apparaissent pour le CoA lié de manière flexible et le LD lié sous-stoechiométriquement. .

La reconstruction de l'OGDHc dihydrolipoyl succinyltransférase (E2o) met en évidence une large similitude avec l'homologue humain surexprimé et inactif en termes de pli global mais avec des adaptations localisées (Fig. 4). L'E2o N-ter dans les structures précédemment publiées n'acquiert pas de pli spécifique (Fig. 4A). En revanche, chez C. thermophilum, cet élément obtient une conformation de brin β (E188-M194) qui, avec un motif en épingle à cheveux β des résidus N266 - D282, crée une feuille β étendue (Fig. 4B). Cette adaptation contribue à la stabilisation du noyau via une liaison hydrogène étendue et affecte l'inter-communication des sous-unités dans l'état d'ordre supérieur du noyau E2o cubique 24-meric. Ce pli impose une condensation du trimère central E2o par rapport à son homologue humain précédemment publié, traduit dans une distance centroïde inférieure entre les sous-unités (Fig. 4C, Fig. 4A supplémentaire). La notation ultérieure basée sur l'énergie des interfaces inter- et intra-trimériques human10 et C. thermophilum (Fig. 4B, C, Méthodes supplémentaires) montre des scores systématiquement plus élevés pour les interfaces E2o thermophiles natives. Considérant que la surface enfouie est proportionnelle aux constantes de dissociation mesurées expérimentalement (KD) des complexes biomoléculaires qui ne subissent pas de grands changements de conformation25, nos résultats suggèrent une liaison plus forte des enzymes C. thermophilum E2o. Conformément à cette notion, les interfaces intra- et inter-sous-unités de C. thermophilum sont 1, 7 et 1, 5 fois plus grandes que les interfaces correspondantes du noyau E2o humain (Fig. 4B, C supplémentaires) et incluent des interactions charge-charge étendues (Fig. 4B, C). Une autre conséquence de la compaction précitée est le confinement induit du E2o N-ter LD. Une feuille β antiparallèle a une plus grande stabilité par rapport à la conformation en boucle précédemment résolue26. Les tôles antiparallèles et mixtes peuvent supporter à la fois les déformations (torsions et renflements β) et l'exposition au solvant ; par conséquent, l'élément structurel nouvellement identifié peut servir de point d'ancrage pour restreindre les conformations explorées par la région flexible reliant les deux domaines E2o ordonnés, c'est-à-dire la succinyltransférase formant le noyau E2 et les LD portant les intermédiaires.

Une protéine E2o de C. thermophilum (orange) alignée avec son homologue humain (cyan). Les différences notables incluent une conformation de virage plus serrée résultant en un meilleur alignement du modèle en épingle à cheveux β de C. thermophilum et de la conformation du brin β du N-ter de C. thermophilum. B Le motif en épingle à cheveux β de N266-D282, ainsi que le brin β N-ter E188-M194 forment un feuillet β qui contribue à la stabilité globale du noyau. C Représentation schématique du déplacement rotationnel du trimère de vertex E2o humain par rapport au trimère E2o de C. thermophilum résolu expérimentalement, affichant une conformation "lâche" pour la contrepartie mésophile.

Au cours de la catalyse (Fig. 1B) dans le métabolon actif OGDHc que nous avons capturé (Fig. 2B), le bras flexible E2o tenant le LD fait la navette entre l'intermédiaire succinyle de l'E1o vers les sites actifs E2o et est réoxydé par l'E327; Par conséquent, la lysine lipoylée du LD doit avoir un accès sans entrave à chaque site enzymatique. Pour caractériser structurellement ces interfaces transitoires, une modélisation AlphaFold-Multimer28 des trois interfaces de composants intégrés au métabolon (E1o-LD, E2o-LD et E3-LD) a été réalisée. Les modèles générés pour les trois complexes (Fig. 5A – D, Méthodes) sont de haute qualité et leurs interfaces prédites se classent en toute confiance dans l'erreur expérimentale (Fig. 5A, B supplémentaires). De plus, (a) l'ajustement du LD dans la densité proximale du noyau E2o dérivé par cryo-EM (Fig. 3D) est similaire à celui prédit par AI en termes de positionnement (Fig. 5B) et (b) la distance de la lysine lipoylée au cofacteur ou au site actif pour toutes les interfaces générées est comprise entre 10 et 25 Å (Fig. 6A – D supplémentaire). Cette plage correspond à la longueur de la chaîne latérale de la lysine et du lipoate et reflète également la flexibilité intrinsèque des protéines en interaction15, également observée dans une interface bactérienne récente PDHc E2o-LD24. E1o forme un homodimère (Fig. 5A), avec deux diphosphates de thiamine (ThDP) et potentiellement deux sites de liaison LD localisés à l'interface inter-chaîne E1o (Fig. 5A). La distance de la lysine lipoylée à l'atome ThDP C2 qui est succinylé pendant la décarboxylation de l'α-cétoglutarate est biochimiquement réalisable (d = 14 Å) (Fig. 6A supplémentaire). E2o lie un seul LD par monomère (Fig. 5B) et la lipoyl-lysine est proximale par rapport au CoA lié, avec une distance de groupe thiol lysine Cα-CoA de d = 10 Å également (Fig. 6B supplémentaire). Enfin, le site actif E3 localise un pont disulfure conservé et une histidine à proximité impliqués dans la réaction de réoxydation LD médiée par E329,30,31. Le complexe E3-LD à base d'IA montre que la lysine lipoylée est à une distance raisonnable pour accéder à la liaison disulfure dans le site actif E3 (d = 23 Å) (Fig. 6D supplémentaire). Notez qu'un deuxième modèle de conformation alternatif pour les complexes E1o-LD et E3-LD a été généré (Fig. 5B supplémentaire, Fig. 6C, D supplémentaire) mais n'a pas satisfait aux contraintes biochimiques mentionnées ci-dessus essentielles pour un métabolon actif (Fig. .2B).

Un modèle dérivé de l'IA de l'interaction E1o-LD. Le modèle global, l'énergétique (interactions VdW Van der Waals, énergie de désolvatation DS, électrostatique ES) et la surface enterrée (BSA), ainsi que la charge globale de son interface d'interaction avec le LD peuvent être vus respectivement à gauche, au milieu et à droite. B Modèle dérivé de l'IA de l'interaction E2o-LD. Le modèle global, l'énergétique et la surface enterrée, et la charge globale de son interface d'interaction avec le LD peuvent être vus respectivement à gauche, au milieu et à droite. C Modèle dérivé de l'IA de l'interaction E3-LD. Le modèle global, l'énergétique et la surface enterrée, et la charge globale de son interface d'interaction avec le LD peuvent être vus respectivement à gauche, au milieu et à droite. D Modèle dérivé de l'IA du domaine LD ordonné de E2o. Lys42 porte le fragment lipoyle. Une interface d'interaction fortement chargée négativement est observable. Les valeurs originales pour le tracé peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 5.

Les interfaces biochimiquement validées (E1o-LD, E2o-LD et E3-LD) et cryo-EM- (E2o-LD) générées par l'IA et intégrées au métabolon partagent une caractéristique commune, révélée après avoir soumis chacune à un raffinement basé sur l'énergie (Fig. 5A–C) : Toutes les interfaces sont régies par de fortes interactions électrostatiques d'amplitude comparable (Fig. 5A–C) qui comprennent une composante énergétique de signature pour les interfaces transitoires avec des taux d'activation/désactivation élevés32. L'électrostatique complémentaire (Fig. 5D) est une caractéristique collective des métabolons faisant la navette entre les intermédiaires via un mécanisme de "bras oscillant"33 et d'autres processus métaboliques nécessitant une commutation marche/arrêt rapide34,35. En effet, les cartes de potentiel électrostatique mettent en évidence de vastes régions chargées positivement pour les liants LD (Fig. 5D). Ces surfaces attirent et accueillent la surface chargée négativement du LD et contribuent globalement au compactage structurel des complexes oxo-acides déshydrogénases36 qui est un principe clé pour obtenir une canalisation métabolique via le mécanisme du "bras oscillant"37.

Pour élucider le protéome plus large et ses interactions au sein de l'extrait actif, nous avons effectué des expériences de réticulation basées sur la spectrométrie de masse directement dans l'extrait (méthodes) tout en comparant les concentrations de réticulant (Fig. 7A, B supplémentaires). Dans l'ensemble, avec un FDR de 2 % au niveau de la récupération des peptides (Méthodes), nous avons récupéré 4 949 reticulations résidus-résidus (3 632 reticulations intra- et 1 317 inter-résidus), dont 99,4 % cartographiés sur les chaînes polypeptidiques de C. thermophilum (Données supplémentaires 2). Sur un total de 2091 chaînes polypeptidiques, 505 chaînes polypeptidiques ont été réticulées sur 2 réplicats biologiques et 2 réplicats techniques (Données supplémentaires 2). Cela montre que 29,1% du protéome total de C. thermophilum s'organise en communautés cellulaires38 qui sont significativement plus grandes que celles décrites précédemment19.

L'analyse du réseau a identifié 54 communautés cellulaires de divers compartiments cellulaires (Données supplémentaires 2) auxquelles participent 1488 membres identifiés. La couverture des sous-unités dans les communautés est élevée (67 % +/- 24 %) et comprend des exemples tels que l'appareil de traduction cytoplasmique complet (N = 128, 96 % des sous-unités) et mitochondrial (N = 74, 99 % des sous-unités). De plus, nous identifions toutes les sous-unités de la communauté du cycle pyruvate déshydrogénase/acide tricarboxylique réticulées ensemble (PDHc/TCA, N = 25, 100 % des sous-unités, données supplémentaires 2). Au sein de la communauté PDHc/TCA, les liens croisés définissent les interactions au sein et entre onze enzymes participantes (122 liens intra et 169 liens, données supplémentaires 2). La protéine E3 présentait le plus grand nombre de liaisons croisées identifiées dans l'expérience (N = 88) et a été trouvée à proximité de sept autres membres de la communauté (Fig. 6A), indiquant son rôle diversifié dans le métabolisme mitochondrial ; Les protéines E3 explorent les positions spatiales proximales avec toutes les sous-unités de PDHc (E1p, E2p, E3BP), OGDHc (E1o, E2o) et une sous-unité du métabolon hypothétique de l'hème mitochondrial39, interagissant au sein de ce dernier avec une holocytochrome c synthase (HCC) putative ( figure 6A). Cependant, l'analyse de séquence a mis en évidence une protéine ribosomale fusionnée et mal annotée au HCC N-ter (Fig. 8 supplémentaire) qui correspond à la sous-unité eucaryote insaisissable KGD4 OGHDc qui relie l'E3 au noyau OGDHc E2 (résidus M1 - T130). Ce N-ter partage une grande similitude avec KGD4 d'autres eucaryotes (Fig. 8 supplémentaire). La réanalyse des données MS19 sur les fractions cellulaires montre une forte co-élution de KGD4 avec le reste des sous-unités OGDHc dans les trois réplicats biologiques (Données supplémentaires 2). Parce que sa fonction est essentiellement la même que la PDHc E3BP - attacher E3 au noyau E2 - nous avons désigné la protéine co-éluante comme la protéine E3BPo de C. thermophilum.

A Inter-crosslinks de E3 révèlent une pléthore de partenaires d'interaction. B Les composants de la protéine OGDHc sont hautement interconnectés. Les lignes bleues représentent les liaisons inter-protéines et les violettes les liaisons intra-protéines.

44 liaisons croisées uniques inter- et 81 intra-moléculaires ont été identifiées dans les composants OGDHc (E1o, E2o, E3, E3BPo) (Fig. 6B); les réticulations intra-moléculaires corroborent davantage les modèles moléculaires E1o, E2o et E3 (Fig. 9A supplémentaire). En détail, 92,3 %, 90 % et 100 % des liens croisés cartographiés sont satisfaits pour E1o, E2o et E3, respectivement. La distribution des distances de réticulation (Fig. 9A supplémentaire, données supplémentaires 2) récapitule en outre la distribution de distance log-normale attendue40 et corrobore la qualité des modèles dérivés de l'IA biochimiquement et structurellement validés. Les réticulations intermoléculaires définissent globalement un état relativement compact de l'OGDHc car des enzymes non connues pour former des interfaces physiques (E1o/E3 ; E3BPo/E1o) sont toujours présentes à proximité relative (Fig. 6B). La proximité relative de E1o et E3 avec le noyau E2o indique l'implication de la région flexible N-ter de E2 se localisant en aval du LD dans la séquence primaire (Fig. 6B). Ce résultat nous a amenés à utiliser l'amarrage moléculaire flexible piloté par la réticulation des modèles d'interaction précédemment validés du LD avec l'E1o et l'E3 pour élucider les surfaces d'interaction échantillonnées par le LD (Fig. 7A – C).

A Tracés de fréquence des résidus impliqués dans l'interface de liaison entre LD et E1o (en haut) et LD et E3 (en bas). B Les fréquences de résidus de chaque résidu impliqué dans l'interaction entre le LD (rose) et l'E1o (gris) révèlent une interface "guidante" (bleue) entre les deux qui oriente le LD vers sa poche de liaison (violet). C Les fréquences de résidus de chaque résidu impliqué dans l'interaction entre le LD (rose) et l'E3 (gris) révèlent une interface "guidante" (bleu) entre les deux qui oriente le LD vers sa poche de liaison (violet). Les valeurs originales pour le traçage peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 6.

Nous avons calculé la fréquence des résidus E1o ou E3 impliqués dans la liaison LD à partir des résultats d'amarrage (Fig. 7A) après avoir adapté nos protocoles d'amarrage pour incorporer la cartographie des liaisons croisées dans les régions désordonnées proximales aux domaines ordonnés dans les interactions protéine-protéine (Méthodes, 25). La cartographie des 25 % supérieurs de résidus impliqués dans la liaison de LD dérivés de 400 modèles moléculaires raffinés à solvant explicite illustre une surface d'attraction distincte pour que le LD se lie éventuellement aux sites actifs respectifs (Fig. 7B, C). Les résidus de sites actifs sont identifiés comme fréquemment contactés pour E1o (Fig. 7B) et E3 (Fig. 7C), mais la surface d'attraction pour E1o est plus diffuse en termes de points chauds récupérés par rapport à celle calculée pour E3 (Fig. 7B, C). Cette diffusion de signal plus élevée pour la liaison LD dans l'E1o suggère que la surface proximale peut guider le LD vers la poche de liaison E1o car elle est assez profondément enfouie (Fig. 7B). Pour l'E3, au contraire, la "surface de guidage" est beaucoup plus confinée (Fig. 7C) dans un espace étroit s'étendant de manière équilatérale à environ 5 Å du site actif E3 plat. Ces résultats indiquent des mécanismes d'attraction LD distincts pour les sous-unités périphériques E1o et E3 régies par des régions flexibles positionnées en aval du LD.

Les liaisons intra-réticulées identifiées valident non seulement la présence des protéines participantes et leurs structures dérivées de l'IA (Fig. 9A supplémentaire), mais confirment également qu'elles forment des structures multimériques ; les liaisons intra-réticulées pour E3BPo n'ont pas été identifiées (figure 6B), ce qui peut indiquer que l'E3BPo participe à la formation du complexe en tant que monomère ; par copie E3BPo, un seul E3 est attaché via sa région N-ter flexible au noyau E213. La traduction des scores iBAQ en données stoechiométriques qualitatives comme précédemment pour PDHc14 indique une stoechiométrie exacte de 24 sous-unités E2o, validée par cryo-EM ; et les stoechiométries relatives de <10 dimères E1o et ~ 4 E3BPo, attachant 4 dimères E3 au total (Fig. 9B, C supplémentaires). Étant donné que E3 est également à proximité des régions désordonnées E2o et de son domaine LD E2o proximal, il est bien possible que davantage d'E3 puissent être logés. Cependant, étant donné que le noyau E2 peut recruter jusqu'à 48 molécules, totalisant un métabolon de 96 chaînes polypeptidiques (24 monomères E2o et maximum 24 E3BPo, chacun regroupant respectivement 12 dimères E1o et 12 E3), les stoechiométries relatives révèlent une composition sous-stoechiométrique du périphérique sous-unités OGDHc. Cela indique la présence de régions centrales N-ter E2o flexibles non liées impliquées dans le trafic de LD.

Pour élucider l'architecture d'ordre supérieur de l'OGDHc dans l'extrait, nous avons effectué des reconstructions asymétriques à partir des données à une seule particule, conduisant à des projections 2D où les densités externes étaient visibles (Fig. 8A). Dans ces densités externes, les dimères E1o et E3 identifiés doivent être localisés, chacun attaché via les régions flexibles du N-ter de l'E2o (Fig. 6B) ou, dans le cas de E3, l'E3BPo flexible (Fig. 6B ,13). La carte cryo-EM (Fig. 8B) a été déterminée à une résolution de 21 Å (Fig. 3B supplémentaire, Tableau supplémentaire 1), présentant des densités autour du noyau E2o, de manière groupée et non diffuse (Fig. 8B). L'augmentation des seuils de densité de la carte cryo-EM a montré des densités supplémentaires plus faibles (Fig. 8B). L'ajustement systématique des modèles E1o-LD et E3-LD dérivés d'AlphaFold2 de C. thermophilum (Fig. 8B, Fig. Supplémentaire 10A, B, Données supplémentaires 3) dans la carte cryo-EM a résolu la localisation de ces molécules et suggère qu'elles sont présentes en périphérie et non sur ou dans les densités du cœur. De plus, des solutions d'amarrage persistantes qui récapitulaient les positions de E1o et E3 sur la carte ont été calculées à partir des modèles structurels systématiquement ajustés associés à des valeurs de corrélation croisée élevées (Données supplémentaires 3, Fig. 10A, B supplémentaires) : Dans l'ensemble, 2 E1o et 3 dimères E3 ont pu être résolus dans les densités externes calculées.

Une classe 2D moyenne de l'OGDHc présente un noyau de signal élevé, entouré d'un signal plus diffus mais toujours bien défini en périphérie. Barre d'échelle : 5 nm. B La reconstruction 3D asymétrique de l'OGDHc affiche une forte densité correspondant au noyau E2o, et un mélange de densités externes plus faibles et plus fortes. Dans les densités plus fortes, les dimères E1o et E3 peuvent être localisés avec une grande confiance. Barre d'échelle : 10 nm.

Alors que les enzymes E1o et E3 attachées sont distribuées de manière asymétrique à proximité du noyau E2o, elles conservent des distances approximativement égales du noyau lui-même (Fig. 8B). La flexibilité inhérente de la région d'attache dans OGDHc ne concilie pas avec les calculs physico-chimiques ou statistiques pour les régions protéiques flexibles de différentes catégories (par exemple, IDP, globule fondu, entièrement étendu; Fig. 10C supplémentaire). Selon la longueur du lieur E2o mesurée dans notre reconstruction 3D dérivée (Fig. 9A, Fig. 10C supplémentaire), les régions flexibles OGDHc ont des propriétés entre les longueurs calculées des IDP "étirés" (IDP tels que définis dans Marsh et Forman-Kay41) et des lieurs « resserrés » (tels que définis par George et Heringa42). Pour élucider si les distances mesurées entre les enzymes participant à l'OGDHc ordonnées qui sont médiées par des régions flexibles peuvent être récapitulées dans les données structurelles disponibles, nous avons calculé la distance des résidus d'acides aminés qui sont résolus mais qui sont plus éloignés séquentiellement en raison d'un étirement non résolu dans le données structurelles. Si diverses raisons techniques peuvent expliquer la présence de ce tronçon non résolu, il peut également être un indicateur de désordre structurel43. En analysant toutes les données structurelles de la Protein Data Bank (PDB) 44 en juin 2022 (191 144 structures), les résultats montrent des distances considérablement confinées entre les résidus ordonnés précédant et suivant l'étirement "manquant" (Fig. 9A). Cela signifie que les données structurelles actuelles de la PDB incluent très rarement des interactions du type de celles rapportées dans nos résultats (Fig. 8B, Fig. 9A). Un "aplatissement" relatif des distances calculées pour les tronçons polypeptidiques absents de plus de 25 résidus d'acides aminés est évident (Fig. 9A), et les distances Ca-Ca maximales rapportées en moyenne à ~ 30 Å, qui sont sensiblement plus courtes que celles du métabolon OGDHc .

Un graphique représentant les valeurs de distance moyenne des groupes groupés de toutes les séquences d'acides aminés non résolues appartenant à toutes les structures protéiques déposées dans le PDB. Les points noirs représentent la valeur moyenne d'une longueur de groupe d'acides aminés, avec différentes échelles de gris l'écart type après l'intégration de chaque quartile des données totales, comme indiqué dans la légende du tracé. La ligne rouge représente un modèle ajusté qui décrit la relation entre la distance et la longueur des groupes d'acides aminés. Avec le vert clair, la distance moyenne mesurée expérimentalement entre le N-ter du domaine central résolu de l'E2o et le C-ter du LD qui est lié à un dimère E1o ajusté à la périphérie, tandis que le vert foncé représente la même distance moyenne expérimentalement mesuré entre le N-ter du domaine central résolu de l'E2o et le C-ter du LD qui est lié à un dimère E3 ajusté. La ligne bleue représente la distance théorique d'une séquence d'acides aminés, tandis que la ligne bleue pointillée représente la limite inférieure théorique de toute séquence d'acides aminés. B Représentation schématique de l'organisation des sous-unités périphériques de l'OGDHc résolu. C Modèle décrivant l'ensemble des observations inédites concernant l'organisation de l'OGDHc. La conformation de la feuille β N-ter du trimère de vertex du noyau E2o aide à stabiliser et à compacter le noyau E2o 24-mer, tout en orientant simultanément le lieur flexible qui relie le domaine LD. Les données de réticulation révèlent une interaction assez stable entre le lieur flexible et les sous-unités périphériques, suggérant peut-être un rôle structurel d'un domaine LD non chargé, tandis qu'un autre domaine LD chargé effectue le cycle de réaction. L'interaction entre le LD et les sous-unités périphériques est régie par de fortes forces électrostatiques.

Nos découvertes combinées élargissent notre compréhension de l'architecture proposée du complexe oxoglutarate déshydrogénase dans le contexte d'un extrait cellulaire producteur de succinyl-CoA (Fig. 9B, C). Le cœur du complexe est une ultrastructure cubique robuste où les trimères E2o qui composent les sommets sont densément emballés à l'aide d'éléments de structure secondaire multi-sous-unités (domaine central N-ter feuillet β). Ce garnissage dense du noyau pourrait être soit une adaptation thermophile, comme indiqué précédemment dans le cas du complexe pyruvate déshydrogénase apparenté14,15, soit une caractéristique générale de l'OGDHc endogène. Cependant, bien que OGDHc soit considéré comme similaire à PDHc, les conformations E2 N-ter endogènes sont distinctes : dans OGDHc, le E2 N-ter est replié dans une conformation de brin β, faisant partie d'un feuillet β inter-chaînes ; dans PDHc endogène, cet élément N-ter est flexible. De telles adaptations structurelles élargissent notre point de vue sur les déterminants de spécificité possibles pour la liaison de LD distinctement chargés à différents noyaux E2 dans les déshydrogénases d'acides oxo.

Une autre observation que nous avons dérivée est que le même élément structurel confine l'espace disponible des lieurs flexibles N-ter étendus qui attachent le domaine LD qui est le domaine crucial pour le transport des substrats à travers des sites actifs séquentiels qui participent à la réaction, à environ 50–100 Å pour l'interaction LD-E1o et 60–70 Å pour l'interaction LD-E3. Il est également à noter que la complémentarité électrostatique pilote la liaison du LD à ses différents liants (E1o, E2o, E3). Le lieur flexible et le LD de E2o, basés sur nos données XL-MS, peuvent également agir comme une "ancre" qui, en l'absence de domaines de liaison de sous-unités périphériques spécifiques dans la séquence E2o N-ter, maintient les sous-unités E1o et E3 dans proximité du noyau E2o. Le domaine N-ter désordonné d'E1o a récemment été résolu pour interagir avec le site de liaison E1o-LD45 et peut en outre aider à organiser E1o à proximité du noyau E2o en interagissant avec d'autres interfaces de liaison LD dans le métabolon. E1o et E3, étant des homodimères, contiennent deux sites de liaison LD suggérant que l'un joue un rôle actif dans la réaction, tandis que l'autre peut maintenir une liaison électrostatique complémentaire hautement chargée avec un domaine LD proximal "déchargé". Ce domaine LD "déchargé" peut participer en tant qu '"ancre", éventuellement également assisté par d'autres interactions plus faibles du lieur flexible avec les résidus de surface des sous-unités périphériques ainsi que la protéine E3BPo identifiée, également capturée dans nos données XL-MS pour organiser la protéine E3. Le rôle "structurel" des domaines LD supplémentaires peut également être suggéré par la relation sous-stoechiométrique entre le noyau E2o et les sous-unités périphériques E1o-E3-E3BPo, telle que quantifiée par les données MS présentées ici. La combinaison de méthodes de biologie moléculaire pour surexprimer les sous-unités E1o, E3, E3BPo et effectuer des expériences de mélange avec la fraction d'extrait cellulaire contenant de l'OGDHc permettrait éventuellement d'obtenir des informations plus approfondies sur l'interaction de la stoechiométrie, des interactions et des adaptations de la structure moléculaire du métabolon. Ce travail, aidé par la protéomique quantitative avec des peptides marqués pour déterminer avec précision les stoechiométries dans l'extrait, et donc les concentrations, fournirait un matériel important pour comprendre la fonction OGDHc avec cryo-EM.

Dans l'ensemble, dans ce travail, nous avons caractérisé le contenu complet d'un extrait cellulaire avec des capacités de production de succinyl-CoA, et élucidé la fonction biochimique et les nouvelles caractéristiques structurelles du principal acteur de la réaction, l'OGDHc et ses composants, E1o, E2o, E3, E3BPo . Notre travail soulève des questions qui doivent être abordées : y a-t-il une interaction in-fraction entre les multiples communautés de protéines présentes ? Comment caractériser leurs relations biochimiques et structurales ? Ces questions ne peuvent être résolues qu'en utilisant la cryo-EM automatisée à haut débit d'un extrait cellulaire entièrement réticulé à haute densité, combinée à une collecte de données à plus grande échelle pour résoudre les problèmes de flexibilité complexe et de faible abondance relative d'éléments individuels. . Les progrès de l'instrumentation46, de la collecte de données47 et de l'analyse48,49, ainsi que l'avènement d'une modélisation précise basée sur l'IA50, permettront de rationaliser la caractérisation des extraits de cellules natives. Il est possible que dans un futur proche notre approche conduise à de nouveaux paradigmes d'analyse enzymatique dans le contexte d'autres métabolons cellulaires qui restent insaisissables.

Chaetomium thermophilum var. thermophilum La Touche 1950 (Thermochaetoides thermophila51) a été acquis auprès de DSMZ (Institut Leibniz DSMZ-Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires, Allemagne), et les spores conservées dans des ampoules lyophilisées ont été cultivées conformément aux directives de l'entreprise (DSMZ Media list Medium 188 , température : 45 °C). Après la culture initiale, le mycélium a été propagé dans un milieu de culture complet liquide (CCM), contenant pour 1 000 ml de ddH2O : 5,00 g de tryptone, 1,00 g de peptone, 1,00 g d'extrait de levure, 15,00 g de dextrine, 3,00 g de saccharose, 0,50 g de MgSO4 × 7 H2O, 0,50 g NaCl, 0,65 g K2HPO4 × 3 H2O et 0,01 g Fe2(SO4)3 × H2O. Le pH final du CCM a été ajusté à 7,1. Les cultures finales ont été réalisées comme suit : Cultures sur plaques en milieu solide : le CCM liquide a été additionné de 15,00 g d'Agar/1000 mL de ddH2O et les plaques ont ensuite été inoculées avec du mycélium et cultivées à 54 °C. Cultures en milieu liquide : des flacons Erlenmeyer de 2 000 mL ont été remplis à 40 % du volume total (800 mL) avec du milieu CCM liquide, de petits morceaux de mycélium fraîchement cultivé provenant de plaques de gélose ont été ajoutés, puis incubés sous agitation à 110 t/min et 10 % de CO2 pendant 20 minutes. h.

L'imagerie par microscopie à fluorescence a été réalisée comme suit : un Zeiss LSM880 (Carl Zeiss, Allemagne) avec un objectif 40X sans immersion (plan-Apochromat 40X/0,95 NA) a été utilisé pour imager les échantillons et les images ont été acquises avec le logiciel d'analyse d'image ZEN Black (Carl Zeiss, Allemagne). Pour la coloration de la membrane avec FM 4-64 (ThermoFisher Scientific, USA), le colorant a été dilué dans du DMSO à une concentration de 10 mM ; 1 μL de solution mère a ensuite été ajouté à 1 mL de culture cellulaire liquide de C. thermophilum, atteignant une concentration de travail de 10 μM. Les échantillons ont été imagés après 2 à 3 m de temps d'incubation. Pour la coloration des mitochondries avec MitoTracker orange (ThermoFisher Scientific, USA), le colorant a été dilué dans du DMSO à une concentration de stock de 10 μM; 5 μL de solution mère ont ensuite été ajoutés à 1 ml de culture cellulaire liquide de C. thermophilum, atteignant une concentration de travail de 50 nM. Les échantillons ont été imagés après 10 m de temps d'incubation. L'imagerie par microscopie électronique à transmission (MET) a été réalisée comme suit : des filaments de C. thermophilum de culture liquide fraîchement propagés ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 3 % (Sigma, Taufkirchen, Allemagne) dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (SCP ; pH 7,2) pendant cinq heures à la pièce température. Après fixation, les échantillons ont été rincés dans du SCP et post-fixés avec du tétroxyde d'osmium à 1 % (Roth, Karlsruhe, Allemagne) dans du SCP pendant une heure à température ambiante. Par la suite, les échantillons ont été rincés à l'eau, déshydratés dans une série d'éthanol gradué, infiltrés avec de la résine époxy selon Spurr (1969)52, polymérisés à 70 °C pendant 24 h puis coupés en sections ultra-fines de 70 nm avec un ultramicrotome Ultracut S (Leica, Allemagne). Après la coupe, les sections ont été appliquées sur des grilles de cuivre avec un revêtement de formvar et de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb ont été ajoutés pour la post-coloration dans un appareil spécialisé EM-Stain (Leica, Allemagne). Pour l'imagerie, un Zeiss EM 900 TEM (Carl Zeiss, Allemagne) fonctionnant à 80 keV a été utilisé. Tous les traitements d'images ont été effectués à l'aide du logiciel Fiji53.

Pour préparer l'extrait cellulaire, du mycélium 15 soigneusement cultivé a été isolé à l'aide d'un tamis de taille de pores de 180 μm, puis lavé 3 fois avec du PBS à 3000 × g, 4 min et 4 ° C. Après avoir éliminé toute humidité résiduelle, la pastille a été lyophilisée à l'aide d'un mortier pré-refroidi au N2 liquide et stockée pour une utilisation ultérieure à -80 ° C. Environ 8 g du matériau gelé ont été lysés dans 20 mL de tampon de lyse (HEPES 100 mM pH 7,4, KCl 5 mM, NaCl 95 mM, MgCl2 1 mM, DTT 1 mM, glycérol 5 %, EDTA 0,5 mM, Pefabloc 2,5 mM, bestatine 130 μM, 10 μg mL–1 DNAse, E-64 40 μM, aprotinine 0,5 μM, pepstatine A 60 μM, leupeptine 1 μM), avec 3 répétitions de 6,5 mps de vitesse d'agitation pendant 25 s, 4 °C dans un Homogénéisateur de cellules Fastprep et 3 min de repos dans la glace après chaque répétition. Une étape de centrifugation de 4 000 × g a été utilisée pour sédimenter les plus gros débris cellulaires et une centrifugation à grande vitesse de 100 000 × g a ensuite été effectuée. Le surnageant résultant a été filtré à travers un filtre centrifuge à coupure de 100 KDa et concentré à 30 mg·mL-1.

Le surnageant filtré, concentré à 30 mg·mL-1, a été appliqué à une colonne d'exclusion de taille Biosep SEC-S4000 qui est montée sur un système ÄKTA Pure 25 M FPLC (Cytiva, USA) via une boucle de 500 μL. La colonne a été équilibrée avec un tampon filtré et dégazé contenant 200 mM de CH3COO-NH4+ à pH 7,4 avant l'application de l'échantillon. Le volume de fraction a été fixé à 250 μL et le débit à 0,15 mL·min-1. Sur la base des données MS acquises (voir les détails ci-dessous), la fraction 6 a été sélectionnée pour être testée pour son adéquation en tant qu'extrait cellulaire producteur de succinyl-CoA.

Afin de produire un échantillon de levure équivalent pour la comparaison d'activité enzymatique, la souche Saccharomyces cerevisiae de l'ATCC (American Type Culture Collection PO Box 1549 Manassas, VA 20108 USA; ATCC® 24657TM) a été cultivée dans du milieu YPDG à 30 °C pendant 5 h, à une DO595 de 2,5 (phase exponentielle précoce), puis récolté à 3000 × g pendant 5 min à 4 ° C et lavé avec de l'eau distillée (pastille résultante ~ 7 g). Le protocole ultérieur jusqu'à la préparation finale de l'échantillon est identique à la préparation de C. thermophilum décrite ci-dessus.

Le dosage de l'activité OGDH a été adapté de54. Le dosage enzymatique a été préparé dans un volume de réaction de 100 µL à 4 °C, contenant 100 mM NaCl, 30 mM K2HPO4 (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 2 mM ThDP, 4 mM α-cétoglutarate, 3 mM NAD+, 0,4 mM CoA et 4 µL Cell Counting Kit 8 et 2 µL de lysat cellulaire contenant de l'OGDH. Pour les calculs KM, l'α-cétoglutarate a été titré de 50 à 5000 µM, NAD+ de 25 à 5000 µM et CoA de 5 à 1000 µM. Le mélange réactionnel (sans α-cétoglutarate) a été pré-incubé pendant 5 min à 37 ° C pour les calculs KM du substrat et à 25 ° C à 65 ° C avec des intervalles de 5 ° C pour la caractérisation cinétique en fonction de la température, et la réaction a commencé par addition d'α-cétoglutarate. La formation du produit Formazan par WST-8 du kit de comptage cellulaire 8 a été surveillée toutes les minutes pendant 1 h à 460 nm, et la concentration calculée avec l'équation de Lambert-Beer et le coefficient d'absorption molaire de WST-855 (ε = 3,07 × 104 M −1cm−1). En raison de l'inhibition de l'excès de substrat, les taux de réaction ont été tracés en fonction des concentrations de substrat à l'aide de la double courbe réciproque de Lineweaver-Burk, et les valeurs de KM ont été déterminées au point d'intersection des abscisses de la régression linéaire asymptotique.

Pour les expériences de Western Blotting (WB), des gels coulés en interne, fraîchement préparés, de 1 mm d'épaisseur ont été utilisés avec la composition suivante : phase de séparation : Tris-HCl 370 mM pH 8,8, 10 % p/v d'acrylamide (37,5 : 1), 0,04 % m/v APS, 0,002 % v/v TEMED, 0,1 % m/v dodécylsulfate de sodium (SDS) dans ddH2O, phase d'empilement : 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 5 % m/v acrylamide (37,5:1) , 0,04 % m/v APS, 0,002 % v/v TEMED, 0,1 % m/v SDS dans ddH2O. Les échantillons ont été préalablement mélangés avec un colorant de charge 4x (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 40 % v/v glycérol, 20 % v/v β-mercaptoéthanol, 0,2 % p/v bleu de bromophénol, 8 % p/v SDS) et puis incubé à 100°C pendant 5 min. Pour chaque échantillon natif, environ 400 ng de protéine ont été chargés dans chaque ligne et 5 μL de Precision Plus Protein™ All Blue Prestained Protein Standards (Biorad, USA) ont été chargés dans chaque gel en tant que marqueur. La concentration des échantillons témoins recombinants était d'environ 8 ng. Après le chargement, une électrophorèse sur gel a suivi dans un tampon d'électrophorèse 1X, fraîchement dilué à partir d'un stock 10X (144 g de glycine, 30,3 g de base Tris dans ddH2O) avec un champ électrique appliqué de 100 V pendant 1,5 h. Un système de transfert Trans-Blot® Turbo (Biorad, USA) a été utilisé pour transférer le contenu du gel sur une membrane de nitrocellulose pendant 20 min, avec un champ appliqué préréglé de 25 V (1 A). Le blocage a été effectué pendant 1 h, sous agitation constante dans une solution de TBST/lait à 5 % p/v, puis les membranes ont été incubées à 4 °C pendant 16 h avec l'anticorps primaire (toutes les concentrations d'anticorps appliquées ont été ajustées à 0,2 μg·mL− 1, 2 % p/v TBST/lait). L'anticorps primaire a été éliminé et trois étapes de lavage avec 2 % p/v de TBST/lait ont suivi. La membrane a ensuite été incubée avec l'anticorps secondaire (Goat Anti-Rabbit IgG, Abcam, ab205718, 0,1 μg·mL-1, 2 % p/v TBST/lait) pendant 1 h. Trois autres étapes de lavage de 2 % w/v TBST/lait ont été appliquées et enfin les membranes ont été criblées avec un système d'imagerie ChemiDoc MP (Biorad, USA) et un mélange fluorescent ECL fraîchement mélangé et des temps d'exposition optimaux. Tous les anticorps primaires ont été fabriqués sur mesure par GenScript (New Jersey, États-Unis) et les séquences d'antigène utilisées pour générer les anticorps sont décrites ici : (a) la protéine E1o α/β a une séquence recombinante qui couvre Met-E1o611-818-His6 et un poids moléculaire (MW) de 24 014,67 Da; (b) la protéine E2o a une séquence recombinante qui couvre Met-E2o39-420-His6 et un PM de 42 485,91 Da ; et (c) la protéine E3 α/β a une séquence recombinante qui couvre Met-E335-504-His6 et un PM de 51 341,91 Da.

Pour la caractérisation structurale de l'extrait cellulaire producteur de succinyl-CoA, un échantillon de 3,5 μL d'une concentration finale en protéines de 0,3 mg·mL-1 a été appliqué sur un film de support troué recouvert de carbone de type R2/1 sur une grille de cuivre de 200 mesh (Quantifoil, Allemagne) qui était auparavant déchargée en lueur dans les conditions suivantes : 15 mA, réseau négatif, 0,4 mbar et 25 s de temps de lueur avec un PELCO easiGlow (TED PELLA, USA). La grille a ensuite été congelée en plongée avec un système Vitrobot® Mark IV (ThermoFisher Scientific, USA) après transfert avec du papier filtre Vitrobot® (papier filtre sans cendres de grade 595 ø55/20 mm). Dans la chambre, les conditions ont été stabilisées à 4 ° C et 95% d'humidité, tandis que les paramètres de transfert ont été définis à 0 force de transfert et 6 s de temps de transfert. La grille vitrifiée a été clipsée et chargée sur un microscope électronique à cryotransmission Glacios 200 keV (ThermoFisher Scientific, USA) dans des conditions de cryo et de faible humidité. Les images ont été acquises avec le détecteur direct d'électrons Falcon 3EC et le logiciel EPU (ThermoFisher Scientific, USA) en mode linéaire et dose totale d'électrons de 30 e−/Å2. Avant l'acquisition, le faisceau était aligné pour être parallèle et perpendiculaire à l'échantillon, avec un diamètre de 2,5 μm, tandis qu'une ouverture d'objectif de 100 μm restreignait l'angle de l'objectif. Les paramètres d'acquisition complets sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 1.

Toutes les étapes de traitement d'image ont été réalisées avec le logiciel de calcul haute performance cryoSPARC version 3.3.157. Un jeu de données de 25 803 films a été importé dans un espace de travail dédié. Les algorithmes de correction de mouvement de patch dans le logiciel (multi) et d'estimation de patch CTF (multi) ont été utilisés pour corriger le mouvement induit par le faisceau et calculer les paramètres CTF des micrographies respectivement. Après la conservation de l'ensemble de données, 24 300 micrographies ont été sélectionnées pour les étapes suivantes du processus d'analyse d'image. Des modèles ont été créés à partir d'EMD-1384416 avec le travail de création de modèles (20 modèles générés à espacement égal) et ont été utilisés pour un travail de sélection avec le sélecteur de modèles, ce qui a donné un ensemble de données initial de 3 596 302 particules extraites avec une taille de boîte de 208 pixels. . puis 2D sans référence classés en 200 classes. À partir de la classification 2D initiale, 71 912 particules ont été sélectionnées dans 4 classes et soumises à un raffinement hétérogène, affinant davantage le jeu de particules final à 52 034 particules après avoir rejeté les particules qui ont entraîné des structures de noyau OGDHc E2o mal formées. L'ensemble de particules final a ensuite été élargi par symétrie avec une symétrie octaédrique (O) et utilisé pour la reconstruction finale du noyau avec le travail de raffinement local (nouveau), résultant en une carte de noyau OGDHc E2o de résolution 3,35 Å (critère FSC Gold-standard 0,143) ( Figure supplémentaire 3A). Pour la reconstruction du complexe OGDH complet, les 71 912 particules incluses dans la reconstruction du noyau ont été réextraites avec une taille de boîte plus grande de 288 pixels afin d'inclure le signal des sous-unités situées à la périphérie du noyau. Ils ont ensuite été reclassés en 20 classes 2D et les classes qui présentaient les densités périphériques les plus importantes ont été à nouveau utilisées comme modèle pour un nouveau cycle de sélection de modèles, résultant en un ensemble initial de particules de 2 891 518 particules uniques. Cet ensemble de particules a subi 3 autres cycles de classification 2D, sélectionnant toujours les moyennes de classe qui affichaient un signal de noyau robuste, mais en plus du noyau affichait également un signal de sous-unité périphérique, se retrouvant avec un ensemble de 52 551 particules qui ont finalement été utilisées pour une classification 3D travail avec 10 classes. La classe 0, contenant 5178 particules et affichant les densités périphériques les mieux résolues, a finalement été utilisée pour un raffinement homogène, résultant en une carte OGDHc de résolution 21,04 Å (critère FSC Gold-standard 0,143) (Fig. 9D supplémentaire) qui a ensuite été utilisée pour toute analyse structurelle. Toutes les visualisations cartographiques ont été réalisées avec le progiciel ChimeraX58.

Pour le raffinement de la structure centrale E2o, le modèle initial (PDB ID : 7Q5Q) a été intégré à la densité cryo-EM à l'aide de ChimeraX, puis affiné à l'aide d'un raffinement manuel itératif avec Coot59 et d'un raffinement en espace réel avec Phenix60 avec des paramètres standard. La densité visible cartographiable a été étendue vers le N-ter de l'E2o, de M195 à E188.

Une installation locale d'AlphaFold-Multimer28 a été utilisée afin d'effectuer des prédictions du trimère de vertex central E2o qui a été modélisé dans la carte dérivée expérimentalement, le dimère E1o (Uniprot ID : G0RZ09) et le dimère E3 (Uniprot ID : G0SB20) en complexe avec le domaine E2o LD annoté par Uniprot (numéros de résidus 40 à 115, ID Uniprot : G0SAX9). Toutes les mesures de qualité basées sur AlphaFold2 (erreur d'alignement prédite (PAE) et test de différence de distance locale prédite (plDDT) peuvent être trouvées dans les Fig. 5A, B supplémentaires. Afin de calculer et de visualiser toutes les surfaces électrostatiques, le plugin électrostatique APBS61 a été utilisé dans PyMol (Schrödinger, États-Unis).

Deux protocoles distincts ont été appliqués pour les calculs HADDOCK2.2 déclarés : (a) Affinement HADDOCK62. Ici, le protocole de raffinement a été appliqué pour calculer et comparer l'énergétique des interfaces entre les composants OGDHc et son homologue humain ainsi que les interfaces générées par AlphaFold2 formées par le LD. Dans cette procédure de raffinement, seule l'étape de raffinement de l'eau du protocole HADDOCK a été réalisée, ce qui a montré qu'il corrélait qualitativement l'énergétique calculée avec les affinités de liaison pour les interactions protéine-protéine transitoires en sautant l'étape d'amarrage. Pour cela, les complexes ont été solvatés dans une coquille 8 Å d'eau TIP3P. Le protocole comprenait les étapes suivantes : (1) 40 étapes EM avec la protéine fixée (minimiseur de Powell) et (2) 2 ×40 étapes EM avec des contraintes de position harmonique sur la protéine (k = 20 kcal·mol−1 Å−2 ). Pour le raffinement final de l'eau, un protocole de recuit simulé doux utilisant la dynamique moléculaire dans l'espace cartésien est introduit après l'étape (2). Il se compose de : (1) Période de chauffage : 500 étapes MD à 100, 200 et 300 K. Des contraintes de position (k = 5 kcal·mol−1 Å−2) sont appliquées sur la protéine à l'exception des chaînes latérales à l'interface . (2) Niveau d'échantillonnage : 1250 pas MD. Des contraintes de position faibles (k = 1 kcal·mol-1 Å-2) sont appliquées sur la protéine à l'exception du squelette et des chaînes latérales à l'interface ; et (3) étape de refroidissement : 500 étapes MD à 300, 200 et 100 K. Des contraintes de position faibles (k = 1 kcal·mol-1 Å-2) sont appliquées sur le squelette protéique uniquement, sauf à l'interface. Un pas de temps de 2 fs est utilisé pour l'intégration de l'équation des mouvements et la température est maintenue constante par couplage faible à un bain de température de référence à l'aide du thermostat Berendsen63. Les calculs ont été effectués avec CNS64. Les interactions non liées ont été calculées avec le champ de force OPLS65 en utilisant une coupure de 8,5 Å. Le potentiel électrostatique (Eelec) a été calculé en utilisant une fonction de décalage tandis qu'une fonction de commutation (entre 6,5 et 8,5 Å) a été utilisée pour définir le potentiel de Van der Waals (Evdw). Les calculs de structure ont été effectués sur le serveur Web HADDOCK à https://alcazar.science.uu.nl/ en utilisant l'interface de raffinement. Un total de 200 structures a été généré pour chaque complexe. (b) Amarrage flexible HADDOCK. Le serveur d'accueil HADDOCK a été utilisé, utilisant l'interface gourou. Ici, les contraintes de distance ont été utilisées en appliquant les données de réticulation dérivées correspondant aux résidus LYS du LD et des E1 et E3, respectivement. Les contraintes de distance appliquées sont incluses dans les fichiers haddockparam.web fournis avec cet article. Pour les calculs d'amarrage, l'interface du gourou a été utilisée par défaut, mais l'espace de recherche et de notation a été considérablement étendu. Cela signifie que les structures générées it0 ont été augmentées à N = 10 000 et que les structures notées ont été augmentées à N = 400. Les calculs des résidus d'acides aminés fréquents impliqués dans la liaison du LD ont été produits à partir des interfaces formées à partir du N = 400 final, eau- solutions d'accueil raffinées. Un résidu d'interface est considéré s'il est à proximité de 5 Å de tout autre résidu du LD. Les résidus très fréquents signalés sont ceux qui appartiennent au quartile supérieur (au-dessus de 25 %) dans les fréquences calculées par résidu et ceux-ci ont été tracés avec le serveur Web en ligne BoxPlotR66.

La carte complexe OGDHc qui a été générée à partir des données expérimentales cryo-EM a été utilisée pour identifier le placement des sous-unités périphériques E1o et E3, en complexe avec le domaine E2o LD qui ont été générés par les prédictions AlphaFold-Multimer comme suit : la carte a été affichée dans ChimeraX et après avoir ajusté le noyau E2o au centre, il a été segmenté en une région "noyau" et une région de densité "externe" avec l'outil de carte de segment. Ensuite, une recherche d'ajustement de 100 ajustements a été effectuée pour les complexes E1o-LD et E3-LD et les valeurs de corrélation croisée (CC) pour chaque ajustement ont été répertoriées et séparées en tant qu'ajustement dans la région de densité centrale ou externe. Pour la signification statistique, les deux groupes d'ajustement CC ont été testés avec une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec l'Analysis ToolPak dans Microsoft Excel (Microsoft Corporation, États-Unis) et les valeurs des ajustements peuvent être trouvées dans les Fig. 10A, B et supplémentaires. Données supplémentaires 3. Les parcelles CC ont été tracées avec le serveur Web en ligne BoxPlotR.

Les calculs de distance du lieur E2o de C. thermophilum ont été effectués comme suit : (a) Pour les mesures de distance résolues expérimentalement, après que toutes les sous-unités périphériques avec LD lié ont été ajustées dans la carte complexe OGDH, la distance a été mesurée avec la commande "distance" dans ChimeraX, en commençant du dernier résidu N-ter résolu pour chacune des 3 sous-unités E2o du trimère de vertex central E2o le plus proche inspecté visuellement, aux premiers résidus C-ter du domaine LD modélisé lié aux dimères E1o ou E3 à la périphérie. Toutes les valeurs ont ensuite été moyennées, et les mesures individuelles et les écarts-types calculés peuvent être trouvés dans les données supplémentaires 3. Les calculs théoriques basés sur la longueur désordonnée du lieur (73 aa, ID Uniprot : G0SAX9) ont ensuite été basés sur des équations dérivées publiées par Marsh et Forman-Kay41 , Wilkins et al.67 et George et Heringa42. De plus, pour mieux comprendre la longueur désordonnée du lieur sur la base de structures résolues expérimentalement à partir de l'APB, la base de données complète de l'APB, au 1er juin 2022, a été téléchargée et un total de 191 144 fichiers au format mmCIF, contenant plus d'un demi-million de chaînes ont été analysé. Les régions de liaison manquantes avec leurs séquences correspondantes sont identifiées à partir des entrées "_pdbx_unobs_or_zero_occ_residues" dans les fichiers mmCIF et un total de 399 404 régions manquantes ont été enregistrées. Pour chaque entrée de région manquante, les acides aminés observés gauche et droit sont identifiés à l'aide des données de coordonnées atomiques dans les fichiers mmCIF. Pour chaque région de liaison, les propriétés suivantes sont dérivées (a) la distance Ca-Ca de bout en bout entre les deux résidus observés, mesurée en Å, (b) la longueur de la région de liaison et (c) la séquence du région de liaison. Les longueurs de ces régions manquantes variaient de 1 acide aminé à 3736 acides aminés, et une forte réduction des entrées PDB disponibles a été observée lors de l'augmentation de la longueur de la séquence de liaison, la tendance étant visible dans la Fig. 10E supplémentaire. Pour dériver de meilleures propriétés collectives, les fichiers ont été regroupés en augmentant de manière adaptative la largeur du bac de longueur des acides aminés. Pour 1 à 50 acides aminés, la largeur du bac a été maintenue à 1. À partir de 50, le bord droit du bac augmente progressivement, jusqu'à 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 250 et 4000. À partir des entrées tombant dans chaque bac, la valeur moyenne des distances Ca-Ca a été calculée, et la distance aux quantiles variant de 0,0 à 1,0 par pas de 0,2. Les données analysées sont présentées dans les données supplémentaires 4. Sur la figure 9A, la distance Ca-Ca moyenne, représentée par des points noirs, a été tracée en fonction de la longueur de la région de liaison. Les distances au niveau du quantile (0,0 à 1,0) ont été tracées sous forme de nuance de couleur, comme indiqué dans la légende. Pour référence, une ligne horizontale (bleu pointillé) a été tracée correspondant à 3,5 Å. De même, une ligne (bleu uni) correspondant à 7 Å fois la longueur de la région manquante a été tracée. La relation entre la distance Ca-Ca moyenne (y) et le nombre d'acides aminés de la séquence manquante (x) peut être caractérisée empiriquement par une fonction modèle de la forme : \(y=A\left(1-{e} ^{-{bx}}\right)+3.5\), où l'on observe que les constantes A et b ont des valeurs, 11 et 0,2, respectivement. La fonction du modèle a été tracée sous la forme d'une ligne rouge. Tous les tracés liés aux calculs de distance PDB (Fig. 9A, Supplémentaire Fig. 10D, E) ont été générés avec le package Pandas en Python 3.9. Le graphique à bulles contenant tous les calculs de distance théoriques et expérimentaux (Fig. 10C supplémentaire) a été généré avec le package ggpubr 0.4.0 dans R.

Les calculs de déplacement rotationnel des sous-unités de trimère de vertex E2o de H. sapiens par rapport aux sous-unités de trimère de vertex E2o de C. thermophilum résolues expérimentalement (A, B, C) ont été effectués comme suit : premièrement, C. thermophilum et H. sapiens (APB ID : 6H05 ) Les trimères E2o ont été extraits et alignés sur la sous-unité A dans PyMol. Ensuite, la commande "angle_between_domains" a été utilisée pour calculer d'abord l'angle entre la sous-unité A et B de C. thermophilum. La même chose a été faite pour l'angle entre la sous-unité A de C. thermophilum et la sous-unité B de H. sapiens. Ensuite, les valeurs ont été soustraites. Le même processus a été effectué pour la paire de sous-unités A et C, en gardant à nouveau l'axe de rotation identique, aligné sur la sous-unité A. Une représentation visuelle des domaines mesurés peut être vue sur la Fig. 4A supplémentaire.

Les fractions 3 à 9 du fractionnement du lysat natif de C. thermophilum décrit ci-dessus ont été regroupées en deux pools (3 à 6 et 7 à 9). De chaque pool, 40 μL d'échantillon ont été digérés en solution avec de la trypsine comme décrit précédemment68,69. Pour éviter la précipitation des protéines lors de la réduction et de l'alkylation de l'échantillon, 2 μL de SDS à 20 % ont été ajoutés. 1 μL de DTT 200 mM dans HEPES/NaOH 200 mM pH 8,5 a été ajouté pour réduire les échantillons de protéines, qui ont ensuite été incubés à 56 ° C pendant 30 min. Après réduction, l'alkylation a suivi avec l'ajout de 2 μL de chloroacétamide 400 mM dans HEPES/NaOH 200 mM, pH 8,5 et une autre incubation à 25 °C pendant 30 min. Tout excès de chloroacétamide a été désactivé en ajoutant 2 μL de DTT 200 mM dans HEPES/NaOH, pH 8,5. Après réduction et alkylation, les échantillons ont été utilisés pour la préparation d'échantillons en phase solide en pot unique68,69. Pour cette préparation, 5 μL d'acide formique à 10 % v/v et 2 μL de perles Sera-Mag ont été ajoutés, ainsi que suffisamment d'acétonitrile (ACN) pour obtenir un pourcentage final d'ACN de 50 % v/v, puis suivi d'un 8 incubation min et capture des billes sur portoir magnétique. Les billes ont ensuite été lavées deux fois avec l'ajout de 200 μL d'éthanol à 70% et une fois de plus avec 200 μL d'ACN. Après remise en suspension dans 10 μL de 0,8 μg de trypsine modifiée de qualité séquençage dans 10 μL HEPES/NaOH 100 mM, pH 8,5, les billes ont été incubées pendant une nuit à 37 °C. L'incubation a été suivie d'une étape de nettoyage en phase inverse puis analysée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) avec un spectromètre de masse Q Exactive™ Plus Hybrid Quadripole-Orbitrap™ (ThermoFisher Scientific, USA). Plus précisément, un système UltiMate™ 3000 RSLCnano (ThermoFisher Scientific, USA) équipé d'une cartouche de piégeage et d'une colonne analytique a été utilisé pour la séparation des peptides. Pour le solvant A, 0,1 % v/v d'acide formique dans de l'eau de qualité LC-MS et pour le solvant B, 0,1 % v/v d'acide formique dans de l'eau de qualité LC-MS ont été utilisés. Tous les peptides ont été chargés sur la cartouche de piégeage avec un solvant A réglé sur un débit de 30 mL·min-1 pendant 3 min et élués avec un 0,3 mL·min-1 pendant 90 min de temps d'analyse, en commençant par un solvant B à 2–28 %. élution, puis augmentée à 40 % de B, une autre étape de lavage à 80 % de B et enfin un rééquilibrage aux conditions de départ. Le système LC a été directement couplé au spectromètre de masse à l'aide d'une source d'ions Nanospray-Flex et d'un émetteur Pico-Tip 360–μm OD × 20 μm ID; Pointe de 10 μm. Le spectromètre de masse fonctionnait en mode ions positifs avec une tension de pulvérisation de 2,3 kV et une température capillaire de 275 °C. Les spectres MS à balayage complet avec une plage de masse de 350 à 1400 m/z ont été acquis en mode profil en utilisant une résolution de 70 000 [temps de remplissage maximum de 100 ms ou un maximum de 3e6 ions (contrôle de gain automatique, AGC)]. La fragmentation a été déclenchée pour les 20 meilleurs pics avec une charge de 2 à 4 sur le balayage MS (acquisition dépendante des données) avec une fenêtre d'exclusion dynamique de 20 s (l'énergie de collision normalisée était de 26). Les précurseurs ont été isolés avec 1,7 m/z et les spectres MS/MS ont été acquis en mode profil avec une résolution de 17 500 (temps de remplissage maximum de 50 ms ou une cible AGC de 1e5 ions). Pour l'analyse des données, les données brutes MS ont été analysées par MaxQuant 1.6.170. Les séquences de protéomes de Chaetomium thermophilum ont été téléchargées à partir d'Uniprot avec Proteome ID UP000008066. Les données MS ont été recherchées par rapport aux séquences de protéomes de Chaetomium thermophilum plus la séquence de contaminants communs fournie par MaxQuant. Le réglage par défaut de MaxQuant a été utilisé avec la modification oxydation et acétyle (protéine N-terme). Un seuil de taux de fausse découverte (FDR) de 1 % a été utilisé pour l'identification des protéines, et l'intensité iBAQ a été utilisée pour la quantification des protéines sans étiquette. Lors du calcul de l'intensité iBAQ, les intensités maximales des pics de détection du profil d'élution peptidique ont été utilisées comme intensité peptidique. Ensuite, toutes les intensités de peptides identifiées ont été ajoutées et normalisées par le nombre total de peptides identifiés.

Pour la préparation des échantillons de spectrométrie de masse de réticulation, un titrage pour identifier la concentration optimale de réticulant a d'abord été effectué (Fig. 7 supplémentaire). Les fractions 3 à 9 du fractionnement du lysat natif de C. thermophilum décrit ci-dessus (Fig. 7A supplémentaire) ont été regroupées à un volume total de 1,4 mL et une concentration en protéines de 0,48 mg·mL-1, puis divisées en 7 parties de volume égal dans chaque Tube d'Eppendorf. Dans le premier tube, aucun agent de réticulation n'a été ajouté pour être conservé comme témoin, tandis qu'au reste, 5 µL de 0,16, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5 et 5 mM de l'agent de réticulation BS3 ont été ajoutés respectivement. Les échantillons ont été incubés pendant 2 h sur de la glace et la réaction de réticulation a ensuite été désactivée avec l'ajout de NH4HCO3 50 mM, incubés à nouveau pendant 30 min sur de la glace. Les échantillons ont ensuite été transférés dans un tube compatible avec l'acétone et 4 fois le volume d'échantillon d'acétone froide (-20 ° C) a été ajouté, les tubes ont été vortexés, à nouveau incubés pendant 60 min à -20 ° C et centrifugés pendant 10 min à 15 000 × g. Le surnageant a été correctement éliminé puis les tubes ont été laissés ouverts à TA pour que l'acétone s'évapore. Pour visualiser les résultats de titrage, chacun des culots des 7 tubes a été remis en suspension dans un tampon de chargement d'échantillon SDS-PAGE 1X (dilué à partir d'un stock 4X de Tris-HCl 250 mM pH 6,8, 8 % p/v de dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,2 % m/v de bleu de bromophénol, 40 % v/v de glycérol, 20 % v/v de β-mercaptoéthanol) jusqu'à une concentration finale en protéines de 10/20 μg·mL-1. Les échantillons ont ensuite été bouillis pendant 5 min à 90 ° C, chargés sur des gels préfabriqués Mini-PROTEAN® (BioRad, USA) et électrophorisés pendant 60 min à 150 V. Après l'électrophorèse, les gels ont été lavés deux fois dans de l'eau, colorés avec une coloration Coomassie solution puis décolorée jusqu'à ce que le fond du gel soit entièrement décoloré. Après inspection visuelle des gels, une concentration optimale de BS3 1 mM a été sélectionnée pour procéder à la réticulation de l'échantillon (Fig. 7B supplémentaire). Une fois la concentration optimale de l'agent de réticulation déterminée, les fractions 3 à 9 du fractionnement du lysat natif de C. thermophilum décrit ci-dessus ont été à nouveau regroupées, mais cette fois en deux pools, 3 à 6 et 7 à 9. Dans un tube Eppendorf Protein LoBind pour chaque pool, 100 μL d'urée 8 M ont été ajoutés puis centrifugés pendant une nuit dans un évaporateur centrifuge sous vide à température ambiante. 100 μL de chaque pool ont ensuite été transférés dans chacun des tubes contenant de la poudre d'urée et 100 mM de bicarbonate d'ammonium (ABC) ont été ajoutés. Le DTT a ensuite également été ajouté à une concentration finale de 2,5 mM (à partir d'un stock de DDT 100 mM dissous dans ABC 100 mM) et incubé pendant 30 min à température ambiante. Une fois l'incubation terminée, du 2-iodoacétamide (IAA) a été ajouté à une concentration finale de 5 mM, suivi d'une incubation de 30 min, à température ambiante dans l'obscurité. La réaction a été désactivée par l'ajout de 2,5 mM de DTT pour empêcher la modification de la sérine dans les sites actifs de la trypsine. LysC (1 μg μL-1 stock, dans un rapport de 1: 100, p / p) a ensuite été ajouté et les échantillons ont de nouveau été incubés à température ambiante pendant 4, 5 h. Un ajout d'ABC 50 mM à l'échantillon a réduit la concentration d'urée à <2 M. La trypsine (à partir de 1 μg μL-1 stock, dans un rapport 1:50, p/p) a été introduite dans les échantillons qui ont ensuite été incubés pendant la nuit à température ambiante. , suivi de la procédure de dessalement des TIPS d'extraction STOP And Go (STAGE), comme décrit dans la réf. 71. Les échantillons de peptides réticulés finaux ont été soumis au même processus LC-MS/MS et les résultats ont été analysés comme décrit ci-dessus dans la méthode d'identification des protéines MS. Tous les tracés visualisant les données MS/XL-MS ont été créés avec le serveur Web en ligne xiVIEW72.

Les protéines identifiées à partir de la spectrométrie de masse ont été cartographiées dans les assemblages d'ordre supérieur fournis décrits dans Kastritis et al. (2017)19. Ces assemblages d'ordre supérieur ont été enrichis en utilisant la recherche d'homologie par entrée Uniprot par rapport à la Protein Data Bank, pour inclure également d'éventuelles sous-unités homologues résolues dans les structures PDB après 2017. Pour cela, Blastp a été utilisé (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) par défaut par rapport à la base de données PDB. Ensuite, les réseaux et les communautés fournis dans Kastritis et al. (2017) ont servi de base pour étendre davantage les réseaux signalés dans cette étude. Cela a été réalisé en cartographiant les protéines sur ces réseaux, en les incluant dans la base de données STRING73 et en élargissant les interactions identifiées dans un réseau avec des interacteurs et des communautés de première et deuxième coquilles. Ensuite, des clusters de réseau STRING locaux spécifiques à C. thermophilum ont été récupérés et la couverture par cluster de chaînes est rapportée par une simple division des protéines identifiées sur toutes les protéines présentes dans le cluster STRING. Cela a été effectué à partir de ces réseaux étendus via un back-mapping vers les données MS et XL-MS. Enfin, les réseaux ont été vérifiés pour leur signification biologique en utilisant le critère de détection d'enrichissement dans la base de données74, montrant que les 54 groupes (communautés protéiques) dérivés ici étaient considérablement enrichis en interactions biologiques. La visualisation des réseaux a été réalisée avec Cytoscape75. La récupération du cycle TCA complet a été déduite en utilisant KEGG76.

ID Uniprot : G0S3G5 (synthase putative de l'holocytochrome C de C. thermophilum - longueur de la séquence : 382), ID Uniprot : Q7S3Z3 (caractérisé en13 comme la protéine N. crassa Kgd4 - longueur de la séquence : 130), ainsi que l'ID Uniprot : Q7S3Z2 (N. crassa holocytochrome C synthase putative - longueur de séquence : 317) ont été téléchargés au format.fasta à partir de la base de données Uniprot et alignés avec Clustal Omega77 en deux paires d'alignement distinctes : G0S3G5 avec Q7S3Z3 et G0S3G5 avec Q7S3Z2 séparément. Les fichiers.aln ont été téléchargés et visualisés avec Jalview78. Les résultats d'alignement sont affichés dans la Fig. 8 supplémentaire. Les identifiants de protéines dans Uniprot ont été mis à jour, P9WES7 correspondant désormais à la putative holocytochrome C synthase (longueur : 287 aa) et P9WES8 à l'E3BPo identifié (longueur : 135 aa).

Les modèles dérivés d'AlphaFold2 pour toutes les protéines impliquées dans la formation du métabolon OGDHc, à savoir E1o, E2o et E3, ont été validés pour leur qualité en utilisant les réticulations intra-moléculaires dérivées de l'analyse de réticulation effectuée ci-dessus. Tous les liens croisés intra-moléculaires identifiés de E1o, E2o et E3, respectivement, ont été cartographiés sur les modèles correspondants via l'utilisation d'un script python interne et évalués manuellement pour leur faisabilité. Les distributions de distance ont été tracées pour chaque modèle dans la Fig. 9A supplémentaire, et les données correspondantes sont incluses dans les données supplémentaires 2.

Toutes les analyses statistiques effectuées sont décrites de manière appropriée dans chacune des sous-sections Méthodes et comprennent les méthodes statistiques appliquées pour l'analyse, les intervalles de confiance, le nombre de répétitions biologiques, le nombre de répétitions techniques, les écarts-types et les scores de corrélations croisées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources pour tous les chiffres sont fournies avec ce document dans les éléments de données supplémentaires correspondants. La carte et le modèle Cryo-EM pour le noyau 24-mer natif de l'OGDHc ont été déposés dans EMDB et PDB sous les numéros d'accession EMD-16900 et 8OIU respectivement. La carte cryo-EM asymétrique de l'OGDHc est incluse dans l'EMD-16900. Les films bruts, les micrographies additionnées et les atlas en grille ont été déposés dans EMPIAR sous le numéro d'accession EMPIAR-11502. Les données de spectrométrie de masse sont disponibles en tant que données supplémentaires 2.

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Nous tenons à remercier tous les membres du laboratoire Kastritis pour les discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par l'Union européenne via le financement de la chaire Horizon Europe ERA "hot4cryo" projet numéro 101086665 (à PLK), le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF, programme ZIK) (Grant nos. 03Z22HN23, 03Z22HI2 et 03COV04 à PLK), le Fonds européen de développement régional (EFRE) pour la Saxe-Anhalt (subvention n° ZS/2016/04/78115 à PLK), la Deutsche Forschungsgemeinschaft (numéro de projet 391498659, RTG 2467) et l'Université Martin-Luther de Halle -Wittenberg.

Financement Open Access activé et organisé par Projekt DEAL.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Christian Tüting.

Centre de recherche interdisciplinaire HALOmem, Charles Tanford Protein Center, Université Martin Luther Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Strasse 3a, 06120, Halle/Saale, Allemagne

Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Christian Tüting, Farzad Hamdi, Toni K. Träger, Jaydeep Belapure et Panagiotis L. Kastritis

Institut de biochimie et de biotechnologie, Université Martin Luther Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Straße 3, 06120, Halle/Saale, Allemagne

Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Toni K. Träger & Panagiotis L. Kastritis

Biozentrum, Université Martin Luther Halle-Wittenberg, Weinbergweg 22, 06120, Halle/Saale, Allemagne

Gerd Hause & Panagiotis L. Kastritis

Département de biochimie végétale, Institut de biochimie et de biotechnologie, Université Martin Luther Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Str. 3a, 06120, Halle/Saale, Allemagne

Marta Fratini & Ingo Heilmann

Centre de biologie structurale, Centre de recherche sur le cancer, National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD, 21702-1201, États-Unis

Francis J. O'Reilly

Bioanalytics, Institut de biotechnologie, Technische Universität Berlin, 13355, Berlin, Allemagne

Il montre Rappsilber

Wellcome Centre for Cell Biology, École des sciences biologiques, Université d'Édimbourg, Édimbourg, EH9 3BF, Écosse, Royaume-Uni

Il montre Rappsilber

Institut de biologie chimique, Fondation nationale hellénique de recherche, Athènes, 11635, Grèce

Panagiotis L. Kastritis

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FLK a réalisé le travail expérimental, assisté de FJO en spectrométrie de masse et de TKT en essais cinétiques. GH et MF ont effectué une imagerie cellulaire. FH a acquis les micrographies. IS a calculé les reconstructions cryo-EM et effectué une modélisation informatique. CT a effectué une modélisation informatique. JB a effectué une analyse statistique des distances de liaison. PLK, IH et JR ont obtenu un financement. PLK a conçu le projet. IS et PLK ont rédigé le manuscrit avec les contributions de tous les auteurs.

Correspondance à Panagiotis L. Kastritis.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce manuscrit a déjà été évalué dans une autre revue Nature Portfolio. Le manuscrit a été jugé apte à être publié sans autre examen par Communications Biology. Rédacteur en chef de la gestion principale : Gene Chong.

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Réimpressions et autorisations

Skalidis, I., Kyrilis, FL, Tüting, C. et al. Analyse structurale d'un métabolon générateur de succinyl-CoA endogène de 4 mégadaltons. Commun Biol 6, 552 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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Reçu : 13 mars 2023

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 22 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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