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May 13, 2023

C11orf54 favorise la réparation de l'ADN en bloquant le CMA

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 606 (2023) Citer cet article

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C11orf54 est une ester hydrolase hautement conservée dans différentes espèces. C11orf54 a été identifié comme une protéine biomarqueur des cancers du rein, mais sa fonction exacte reste mal comprise. Ici, nous démontrons que l'inactivation de C11orf54 diminue la prolifération cellulaire et améliore les dommages à l'ADN induits par le cisplatine et l'apoptose. D'une part, la perte de C11orf54 réduit l'expression de Rad51 et l'accumulation nucléaire, ce qui entraîne la suppression de la réparation par recombinaison homologue. D'autre part, C11orf54 et HIF1A interagissent de manière compétitive avec HSC70, l'inactivation de C11orf54 favorise la liaison de HSC70 à HIF1A pour le cibler pour la dégradation via l'autophagie médiée par le chaperon (CMA). La dégradation de HIF1A induite par le knockdown de C11orf54 réduit la transcription de la sous-unité régulatrice de la ribonucléotide réductase M2 (RRM2), qui est une enzyme RNR limitant le débit pour la synthèse et la réparation de l'ADN en produisant des dNTP. Un supplément de dNTP peut partiellement sauver les dommages à l'ADN induits par l'inactivation de C11orf54 et la mort cellulaire. En outre, nous constatons que la bafilomycine A1, un inhibiteur à la fois de la macroautophagie et de l'autophagie médiée par le chaperon, présente des effets de sauvetage similaires à ceux du traitement par dNTP. En résumé, nous découvrons un rôle de C11orf54 dans la régulation des dommages et de la réparation de l'ADN par la diminution médiée par la CMA de l'axe HIF1A/RRM2.

L'intégrité génomique est cruciale pour le maintien de l'homéostasie, le développement normal et la prévention du cancer1. Le stress génomique endogène et exogène provoque des cassures simple brin (SSB) et des cassures double brin (DSB) de l'ADN, entraînant une réponse active aux dommages de l'ADN (DDR)2,3. Les voies DDR détectent, signalent et réparent différents types de dommages à l'ADN, ce qui est crucial pour maintenir la stabilité génomique4. La recombinaison homologue (HR) représente le principal mécanisme de réparation sans erreur dirigée par l'homologie des DSB et des réticulations interbrins (ICL). Le Rad51 et ses paralogues jouent un rôle essentiel dans ce processus5,6. La ribonucléotide réductase (RNR) catalyse les désoxyribonucléotides (dNTP) nécessaires à la synthèse de l'ADN. Les deux sous-unités RRM1 (Ribonucleotide Reductase Catalytic Subunit M1) et RRM2 (Ribonucleotide Reductase Regulatory Subunit M2) constituent le complexe α2β2 pour exercer une activité catalytique, et l'équilibre des dNTP au sein des cellules est vital pour l'homéostasie cellulaire et le maintien de l'intégrité génomique7,8,9. L'enzyme RNR limitant le débit, RRM2, est essentielle à la synthèse et à la réparation de l'ADN en produisant des dNTP10.

Le facteur 1 induit par l'hypoxie (HIF1) est un complexe transcriptionnel dimérique qui participe à de nombreux processus biologiques tels que le métabolisme, l'inflammation et la tumorigenèse11. HIF1A est une sous-unité du complexe HIF1, qui a été modifiée par des prolyl-hydroxylases (PHD) spécifiques de HIF en présence d'O2. HIF1A modifié est dégradé par le protéasome, ce qui nécessite une hydroxylation de la proline dépendante de l'oxygène et une ubiquitination médiée par von Hippel-Lindau (VHL)12. En outre, il a été signalé que HIF1A réglementait le DDR de diverses manières. P-H2A.X est un marqueur des cassures double brin de l'ADN pour amplifier le signal de dommage et recrute des protéines de réparation des dommages à l'ADN13. Dans les cellules cancéreuses, l'inactivation de HIF1A réduit l'accumulation de p-H2A.X induite par l'hypoxie, puis affecte la capacité de réparation des dommages à l'ADN et la résistance à la thérapie tumorale14. La stabilisation médiée par l'hypoxie de HIF1A favorise la transcription de hTERT (transcriptase inverse de la télomérase) et de hTR (composant ARN de la télomérase), puis régule les dommages à l'ADN et la stabilité génomique15,16. Pendant ce temps, la perte de HIF1A pourrait limiter la réparation des cassures double brin de l'ADN et être plus sensible à la chimiothérapie17,18.

L'autophagie médiée par chaperon (CMA) est un type d'autophagie dans lequel les substrats sont directement ciblés sur le lysosome pour la dégradation. Les protéines de substrat CMA sont sélectivement reconnues par la protéine apparentée au choc thermique de 70 kDa (HSC70) et ciblées sur les lysosomes, puis recrutées sur le récepteur membranaire lysosomal de type 2A (LAMP2A) pour la dégradation médiée par le CMA19. Le CMA participe à la réparation de l'ADN et peut prévenir la transformation maligne en maintenant la stabilité du génome19. Des études récentes ont démontré que HIF1A est un substrat CMA et est impliqué dans la régulation du cycle cellulaire. HIF1A est dégradé de manière CMA-dépendante lorsqu'il est ubiquitylé sur Lys63 par l'ubiquitine-protéine ligase E3 STUB120. Checkpoint kinase 1 (CHK1), le régulateur du cycle cellulaire, est un autre substrat CMA. L'inhibition de la CMA provoque la persistance nucléaire de Chk1 pendant la réponse aux dommages à l'ADN, entraînant une accumulation de dommages à l'ADN et altérant la réparation de l'ADN21.

C11orf54 (cadre de lecture ouvert 54 du chromosome 11), également connu sous le nom de PTD012, est un gène hautement conservé exprimé dans Mus musculus, Brachydanio rerio, Drosophila melanogaster et Caenorhabditis elegans22. Le C11orf54 humain contient un ion Zn2+ coordonné à trois résidus d'histidine et présente une activité d'ester hydrolase22. De plus, l'orthologue de Drosophila melanogaster de C11orf54 joue un rôle essentiel dans l'homéostasie des protéines pendant la suralimentation23. C11orf54 a été identifié comme une protéine biomarqueur du cancer de l'endomètre, du carcinome à cellules rénales et du carcinome à cellules claires du rein par électrophorèse sur gel bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse24,25,26. Cependant, sa fonction chez les mammifères n'est pas encore claire.

Dans la présente étude, nous avons découvert que C11orf54 régulait la prolifération cellulaire et l'apoptose. Knockdown de C11orf54 a activé la réponse aux dommages à l'ADN (DDR) dépendant de l'ATM et a inhibé la réparation par recombinaison homologue en réprimant l'expression de Rad51. De plus, nous avons constaté que C11orf54 interagissait de manière compétitive avec HSC70, ce qui interrompait l'interaction entre HIF1A et HSC70. Ainsi, l'inactivation de C11orf54 a amélioré la liaison de HSC70 à HIF1A, entraînant la dégradation de HIF1A via l'autophagie médiée par le chaperon. De plus, le blocage de la CMA par la bafilomycine A1 (BafA1) pourrait partiellement récupérer les dommages à l'ADN induits par l'inactivation de C11orf54 et la suppression de la prolifération cellulaire. Nos données ont démontré que C11orf54 favorise la réparation de l'ADN en bloquant la dégradation médiée par le CMA de HIF1A.

La structure cristalline de C11orf54 l'a révélé comme une hydrolase d'ester, qui pourrait appartenir à la superfamille des protéines repliées métallo-β-lactamase22. C11orf54 est conservé parmi les espèces, y compris Homo sapiens, Mus musculus, Brachydanio rerio, Drosophila melanogaster et Caenorhabditis elegans. C11orf54 s'exprime de manière universelle parmi différents tissus de l'espèce humaine, particulièrement enrichie en tissus rénaux et hépatiques (Fig. 1 supplémentaire). Ainsi, nous avons utilisé 293T et des hépatocytes pour étudier la fonction physiologique de C11orf54.

Une étude précédente a démontré que C11orf54 est principalement localisé dans le nucléaire en utilisant une approche de phénotypage automatique27. Dans une autre étude, C11orf54 a été détecté dans le cytoplasme et le noyau de cellules surexprimées en C11orf5428. Pour étudier la localisation subcellulaire exacte de C11orf54 endogène, nous avons effectué le test de fractionnement nucléaire/cytosolique et l'expérience d'immunocoloration en utilisant les anticorps vérifiés. Tout d'abord, nous avons généré des cellules knockdown C11orf54 à l'aide de deux shRNA différents (shC11orf54-1, shC11orf54-2). Les niveaux de protéines et d'ARNm de C11orf54 ont été significativement réduits dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 1a, b). Ensuite, nous avons surexprimé C11orf54 dans les cellules knockdown pour vérifier la spécificité des anticorps C11orf54 (Fig. 1c). L'absence de transferts a indiqué une construction réussie de la lignée cellulaire knockdown C11orf54 et a également validé la spécificité de l'anticorps C11orf54. Les expériences d'immunocoloration ont montré que C11orf54 endogène était principalement localisé dans le cytoplasme (Fig. 1d, e). De plus, le test de fractionnement nucléaire / cytosol a montré des résultats cohérents indiquant que C11orf54 était principalement observé dans le fractionnement du cytoplasme (Fig. 1f, g). Ces données suggèrent collectivement que C11orf54 est principalement localisé dans le cytoplasme.

a, b Les expériences Western blot (a) et qPCR (b) indiquent l'efficacité de knockdown de C11orf54 (shC11orf54-1, shC11orf54-2) dans la lignée cellulaire PLC/PRF/5. L'ACTB a été utilisé comme contrôle (n = 3 réplicats biologiques, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, ***p < 0,001). c Western blot indique la spécificité de l'anticorps C11orf54 dans les cellules knockdown C11orf54 et la réintroduction de C11orf54 dans les cellules knockdown C11orf54. d Des images d'immunocoloration représentatives confirment la localisation subcellulaire de C11orf54 dans des cellules de type sauvage. Barre d'échelle = 20 μm. e Des images d'immunocoloration représentatives confirment la localisation subcellulaire de C11orf54 dans les cellules PLC/PRF/5 témoins et C11orf54 knockdown. Barre d'échelle = 10 μm. f, g Le test de fractionnement nucléaire/cytosolique montre la localisation subcellulaire de C11orf54 dans la lignée cellulaire PLC/PRF/5 avec deux anticorps vérifiés de Proteintech (f) et Invitrogen (g). GAPDH a été utilisé comme marqueur du cytoplasme (Cyto) et H3 comme marqueur du noyau (Nuc).

Ensuite, nous avons étudié si l'inactivation de C11orf54 affectait la prolifération cellulaire et l'apoptose, qui sont des événements cellulaires clés dans le développement des organismes29. Le test CCK8 a montré que l'extinction de C11orf54 inhibait de manière significative la croissance des cellules PLC / PRF / 5 et 293T (Fig. 2a; Fig. 2a supplémentaire) et la formation de colonies (Fig. 2b, c et Fig. 2b, c supplémentaires). De plus, nous avons détecté un nombre significativement réduit de cellules EdU-positives dans la cellule knockdown C11orf54 par rapport à la cellule témoin (Fig. 2d, e). Ces résultats indiquent que le déficit en C11orf54 supprime la prolifération cellulaire.

un test CCK8 montre la survie cellulaire des cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 (les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, ***p < 0,001). b, c La formation de colonies (b) et les résultats quantitatifs (c) montrent la croissance cellulaire des cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01). d, e La coloration EdU confirme l'effet de l'inactivation de C11orf54 sur la prolifération cellulaire dans la lignée cellulaire PLC/PRF/5. Les images affichent la coloration EdU (couleur rouge) fusionnée avec la coloration DAPI (couleur bleue). (Barre d'échelle = 100 μm ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, ***p < 0,001). f, g Western blots (f) et résultats quantitatifs (g) de l'expression de C11orf54 dans des cellules PLC/PRF/5 traitées avec du cisplatine 10 μM pendant différents temps (0 h, 1 h, 6 h, 12 h et 24 h) (n = 3 répétitions biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET, ***p < 0,001). h Test de viabilité après incubation avec du cisplatine dans des cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 à différentes concentrations (5 μM, 20 μM, 40 μM et 100 μM). i, j Analyse de la formation de colonies de C11orf54 knockdown sur la sensibilité au cisplatine après traitement avec 3 μM de cisplatine pendant 24 h et culture dans un milieu sans médicament pendant 10 jours supplémentaires (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET, * **p < 0,001). k, l Analyse de l'apoptose par double coloration Annexine V(FITC)/Iodure de propidium (PI) (L) et résultats quantitatifs (K) dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown après traitement au cisplatine 10 μM pendant 48 h (n = 4 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET, ***p < 0,001). m, n Western blots (m) et résultats quantitatifs (n) des protéines indiquées dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 après traitement avec 10 μM de cisplatine pendant 48 h (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de moyenne valeurs ± ET, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Fait intéressant, nous avons constaté que l'expression de C11orf54 avait augmenté lors du traitement au cisplatine (CDDP) de manière dépendante du temps (Fig. 2f, g). Pour examiner si d'autres inducteurs génotoxiques pourraient réguler l'expression de C11orf54, nous avons évalué l'expression de C11orf54 lors d'un traitement à l'hydroxyurée (HU) et à la camptothécine (CPT). De même, HU et CPT pourraient également favoriser l'expression de C11orf54 de manière dépendante du temps (Fig. 3a – d supplémentaire). Ces données ont montré que C11orf54 pouvait répondre aux inducteurs génotoxiques, indiquant que C11orf54 pourrait jouer un rôle dans la mort cellulaire induite par les médicaments génotoxiques. En effet, les tests de viabilité cellulaire et de formation de colonies ont montré que les cellules knockdown C11orf54 étaient plus sensibles au cisplatine que les cellules témoins (Fig. 2h – j). La double coloration annexine V (FITC) / iodure de propidium (PI) a montré que l'apoptose des phases précoce et tardive induite par le cisplatine était augmentée dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 2k, l). Le test TUNEL a également démontré que la perte de C11orf54 favorisait l'apoptose sous traitement au cisplatine (Fig. 3e, f supplémentaires). De plus, nous avons constaté que l'inactivation de C11orf54 améliorait le clivage de la caspase 3 et de PARP1, qui jouent un rôle central dans l'exécution de l'apoptose (Fig. 2m, n). Fait intéressant, l'effet de C11orf54 sur l'activation de la caspase3 semblait uniquement en présence de cisplatine, ce qui peut être dû au fait que le cisplatine augmente la tendance à l'apoptose après l'inactivation de C11orf54. Pendant ce temps, une augmentation de BAX pro-apoptotique et une diminution de Bcl-2 anti-apoptotique ont été observées dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 2m, n). Pris ensemble, ces résultats démontrent que le déficit en C11orf54 supprime la prolifération cellulaire et favorise l'apoptose.

Les médicaments génotoxiques provoquent la mort cellulaire en inhibant la synthèse de l'ADN ou en brisant la structure de l'ADN. Nos résultats ont montré que le niveau de protéine de C11orf54 avait augmenté après le traitement médicamenteux génotoxique (Fig. 2f, g et Supplémentaire Fig. 3a – d), indiquant que C11orf54 pourrait être impliqué dans la stabilité du génome ou les dommages à l'ADN. Pour examiner si C11orf54 participe aux dommages à l'ADN induits par les médicaments, nous avons utilisé un test de comète pour détecter les cassures double brin (DSB) après un traitement au cisplatine. Les fragments d'ADN indiqués par l'ADN de la queue et le moment de la queue ont été considérablement augmentés dans les cellules knockdown C11orf54 après le traitement au cisplatine (Fig. 3a – c). De plus, nous avons examiné le niveau de γH2A.X (p-H2A.X-Ser139), qui est reconnu comme un marqueur des dommages à l'ADN30, par coloration par immunofluorescence et test Western blot. Le silençage de C11orf54 a augmenté de manière significative le nombre de foyers γH2A.X (Fig. 3d, e) et le niveau de protéines (Fig. 3f, g) dans des conditions normales et de cisplatine par rapport aux cellules témoins. Ces résultats suggèrent que l'inactivation de C11orf54 favorise les dommages à l'ADN.

a–c Images représentatives du test des comètes dans des cellules PLC/PRF/5 témoins et C11orf54 knockdown (a) et quantification de l'ADN de la queue % (b) et du moment de la queue (c) (n = 20 cellules indépendantes ; les données sont présentées sous forme de moyenne valeurs ± ET ; ***p < 0,001). Barre d'échelle = 30 μm. d, e Images représentatives des foyers γH2A.X (d) et résultats quantitatifs (e) dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 (n = 10 cellules indépendantes ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD ; *p < 0,05 , ***p < 0,001). Barre d'échelle = 10 μm. f, g Western blots (f) et résultats quantitatifs (g) des protéines indiquées dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 lors d'un traitement au cisplatine 10 μM pendant 6 h (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET ; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). h, i Western blots (h) et résultats quantitatifs (i) des protéines indiquées dans le contrôle et les cellules C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 sur cisplatine 10 μM et cisplatine 10 μM plus KU-60019 10 μM pendant 6 h (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET ; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

L'ATM (ataxie-télangiectasie mutée) est l'une des kinases les plus en amont de la voie DDR, dont l'activation peut déclencher la phosphorylation d'une série de kinases telles que Chk1 et Chk231,32,33,34. Nous avons constaté que l'inactivation de C11orf54 favorisait la phosphorylation d'ATM et de son Chk1 / Chk2 en aval dans des conditions normales et un traitement au cisplatine (Fig. 3f, g). Nous avons également pu observer le même phénomène dans les cellules 293T (Fig. 2d supplémentaire). De plus, l'inhibiteur de la kinase ATM KU-60019 pourrait partiellement réprimer l'expression accrue de p-ATM, p-CHK1, p-CHK2 et p-H2A.X dans les cellules knockdown C11orf54 à la fois dans des conditions de traitement contrôle ou cisplatine (Fig. 3h, i) . Ces données suggèrent que l'inactivation de C11orf54 active les dommages à l'ADN dans une voie dépendante de l'ATM.

La réparation de l'ADN est une voie conservée au cours de l'évolution qui peut réparer les dommages à l'ADN provenant de sources endogènes ou exogènes pour maintenir l'intégrité génomique35,36. Nous nous sommes demandé si C11orf54 régule le déficit de réparation de l'ADN. Premièrement, nous avons détecté l'expression de Rad51 et Ku70, deux protéines critiques dans la recombinaison homologue (RH) et la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ), respectivement. Nous avons constaté que l'inactivation de C11orf54 réprimait de manière significative l'expression de Rad51 mais pas de Ku70 (Fig. 4a, b), et les expériences d'immunocoloration ont montré que la perte de C11orf54 inhibait la formation de foyers de Rad51 dans le noyau (Fig. 4c, d), ce qui indiquait que C11orf54 pourrait être impliqué dans la recombinaison homologue. Ainsi, nous avons évalué l'activité de réparation par recombinaison homologue dans les cellules knockdown et témoins C11orf54 à l'aide du système rapporteur HR. Dans ce système, la GFP est interrompue par le site I-SceI et la GFP fonctionnelle peut être restaurée par réparation HR en utilisant la GFP en aval comme modèle après l'expression de I-SceI. Nous avons co-transfecté pDR-GFP et pCBA-SceI dans des cellules knockdown et témoins C11orf54, puis avons enregistré les cellules positives GFP par cytométrie en flux. Nous avons constaté que le pourcentage de cellules GFP-positives était significativement réduit dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 4e, f), ce qui indique que l'inactivation de C11orf54 supprimait l'activité de réparation des RH. De plus, par rapport aux cellules témoins, les cellules knockdown C11orf54 ont montré une clairance plus lente des foyers p-H2A.X après l'arrêt du traitement au cisplatine (Fig. 4g, h). Collectivement, ces données suggèrent que l'inactivation de C11orf54 altère la réparation par recombinaison homologue, ce qui améliore les dommages à l'ADN.

a, b Western blots (a) et résultats quantitatifs (b) des protéines indiquées dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 lors d'un traitement au cisplatine 10 μM pendant 6 h (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET ; ***p < 0,001 ). c, d Images représentatives des foyers Rad51 (d) et résultats quantitatifs (c) dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown au moment indiqué après le traitement au cisplatine (n = 10 cellules indépendantes ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD ; ** p < 0,01). Barre d'échelle = 10 μm. e, f Analyse par cytométrie en flux (e) et résultats quantitatifs (f) des cellules GFP-positives dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 après co-transfection de pDR-GFP et pCBA-SceI (n = 3 réplicats biologiques ; ***p < 0,001). g, h Images représentatives des foyers p-H2A.X (g) et résultats quantitatifs (h) dans les cellules PLC/PRF/5 témoins et C11orf54 knockdown au moment indiqué après le traitement au cisplatine (n = 10 cellules indépendantes ; les données sont présentés sous forme de valeurs moyennes ± ET ; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Barre d'échelle = 10 μm.

Pour identifier le mécanisme potentiel de l'altération de la réparation de la recombinaison homologue induite par le knockdown C11orf54, nous avons analysé les transcriptomes dans les cellules knockdown et témoins C11orf54 par séquençage d'ARN à haut débit (RNA-Seq). Nous avons identifié 708 gènes significatifs exprimés de manière différentielle (303 gènes régulés à la hausse et 405 gènes régulés à la baisse) dans les cellules knockdown C11orf54, qui ont été visualisées par le tracé du volcan (Fig. 5a). Nous avons en outre effectué des analyses fonctionnelles des DEG (gènes exprimés différemment) à l'aide de la base de données KEGG. Les 20 principales voies KEGG régulées négativement ont été répertoriées sur la figure 5b. La glycolyse / gluconéogenèse et la voie de signalisation HIF1 ont été régulées à la baisse dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 5b). De manière cohérente, les résultats de la GSEA ont montré que les ensembles de gènes liés à l'hypoxie (NES = -1,4, p-value = 0,005) et à la glycolyse-gluconéogenèse (NES = -1,5, p-value = 0,011) étaient enrichis dans le groupe pLKO.1 (Fig. 5c). HIF1A est un facteur de transcription connu qui régule la transcription de la glycolyse et des gènes glycolytiques38. Ainsi, nous avons évalué l'expression des gènes cibles HIF1 et des gènes associés à la glycolyse/gluconéogenèse dans les cellules knockdown C11orf54. Les résultats de la qPCR ont montré que la plupart des gènes associés à la glycolyse (GLUT1, GLUT2, PGK1, ENO1, PDK3, LDHA et PDHA1), ainsi que les gènes associés à la gluconéogenèse (FBP1 et PEPCK), étaient significativement diminués dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 5d). De plus, l'inactivation de C11orf54 a réprimé de manière significative le niveau de protéines de PKM2, HK2, LDHA, PFKP et HIF1A (Fig. 5e, f). Ces données indiquent que l'inactivation de C11orf54 supprime la voie de signalisation HIF1A.

un diagramme Volcano montrant les gènes significativement modifiés dans l'échantillon knockdown C11orf54 par rapport à l'échantillon témoin (point rouge : gènes régulés positivement, point bleu : gènes régulés négativement, point gris : aucun gène modifié significatif). b Les 20 principales voies KEGG fonctionnellement enrichies trouvées dans l'analyse des DEG dans le knockdown C11orf54 par rapport à l'échantillon témoin. c L'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA) montre que la voie de signalisation de l'hypoxie et de la glycolyse-gluconéogenèse a tendance à enrichir le groupe knockdown C11orf54. d Analyse de l'expérience qPCR de l'expression de l'ARNm des gènes de la glycolyse dans les cellules knockdown et témoins C11orf54 (n = 4 réplicats biologiques, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). e, f Western blots (e) et résultats quantitatifs (f) des protéines de glycolyse dans les cellules knockdown et témoins C11orf54 (n = 4 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01 ).

Ensuite, nous nous sommes demandé quelle cible en aval de HIF1A était impliquée dans la réparation de l'ADN dans les cellules knockdown C11orf54. Bien que l'interaction entre la glycolyse et les voies de réparation de l'ADN reste incertaine, plusieurs études ont suggéré que la glycolyse pourrait maintenir la stabilité du génome en fournissant des métabolites essentiels au métabolisme de l'ADN39. Par exemple, la voie des pentoses phosphates (PPP) convertit l'intermédiaire de glycolyse (glucose-6-phosphate) en ribose-5-phosphate pour la synthèse des nucléotides et du NADPH afin de réduire les dommages à l'ADN40,41. Ainsi, nous avons évalué le rapport NADPH/NADP+ (un biomarqueur bien connu du PPP) et l'expression de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (l'enzyme limitant le débit du PPP) dans la cellule knockdown et contrôle C11orf54. Cependant, il n'y a pas de différence dans le rapport NADPH / NADP + et l'expression de G6PD entre les cellules knockdown et témoins C11orf54 (Fig. 4a, b supplémentaires), ce qui suggère que l'inactivation des dommages à l'ADN induits par C11orf54 peut ne pas passer par la voie de la glycolyse.

Pour étudier plus en détail comment C11orf54 régule la réparation des dommages à l'ADN, nous avons mesuré les niveaux d'ARNm des gènes impliqués dans la réparation de l'ADN. Comme le montre la figure 6a, la plupart des niveaux de transcription des gènes candidats sont restés inchangés, à l'exception de RRM2. De plus, le niveau de protéine de RRM2 était significativement diminué dans les cellules knockdown C11orf54 dans des conditions de cisplatine et de contrôle (Fig. 6b, c). RRM2, la petite sous-unité de la ribonucléotide réductase, est essentielle à la synthèse et à la réparation de l'ADN en produisant des dNTP42. Il a été rapporté que la voie de signalisation HIF-1α/STAT3 pourrait réguler positivement le niveau transcriptionnel de RRM243,44. Par conséquent, nous avons déterminé si la supplémentation en nucléosides pouvait sauver les dommages à l'ADN induits par l'inactivation de C11orf54. La supplémentation en nucléosides a partiellement réduit les foyers γ-H2AX dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 6d, e). De plus, la formation de colonies supprimée dans les cellules knockdown C11orf54 a également été partiellement restaurée par une supplémentation en nucléosides (Fig. 6f, g). Ces résultats suggèrent que l'inactivation de C11orf54 provoque des dommages à l'ADN en supprimant l'axe HIF1A/RRM2.

une analyse qPCR de l'expression de l'ARNm des gènes cibles de réparation de l'ADN HIF1A en aval dans les cellules C11orf54 knockdown et témoins (n ​​= 4 réplicats biologiques, les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, ***p < 0,001). b, c Western blots (b) et résultats quantitatifs (c) des protéines indiquées dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown après traitement au cisplatine 10 μM pendant 6 h (n = 4 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, ** *p < 0,001). d, e Images représentatives des foyers γH2A.X (d) et résultats quantitatifs (e) dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown lors d'un traitement au dNTP 100 μM pendant 24 h. (n = 10 cellules indépendantes ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD ; **p < 0,01, ***p < 0,001). Barre d'échelle = 10 μm. f, g La formation de colonies (f) et les résultats quantitatifs (g) montrent la croissance cellulaire des cellules PLC/PRF/5 knockdown C11orf54 et des cellules témoins sous traitement dNTP 100 μM pendant 24 h (n = 3 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de moyenne valeurs ± ET, *p < 0,05, **p < 0,01).

Ensuite, nous avons étudié comment C11orf54 régule l'expression de HIF1A. Étant donné que l'inactivation de C11orf54 n'affecte pas le niveau d'ARNm de HIF1 (Fig. 6a), nous avons évalué la dégradation de HIF1A. Tout d'abord, nous avons traité la cellule avec l'inhibiteur de PHD CoCl2, ce qui a entraîné une stabilisation et une accumulation de HIF1A. Cependant, l'inactivation de C11orf54 a systématiquement diminué l'expression de HIF1A lors du traitement au CoCl2 (Fig. 5a supplémentaire), ce qui suggère que l'inactivation de HIF1A réprimé par C11orf54 peut ne pas se faire via la régulation de la stabilisation de HIF1A. Ensuite, nous nous sommes demandé si l'inactivation de C11orf54 provoquait la dégradation de HIF1A par la voie du protéasome ou de l'autophagie-lysosome en utilisant MG132 et BafA1. Nous avons constaté que l'expression de HIF1A était restaurée après le traitement par BafA1, mais pas de MG132 (Fig. 7a, b). BafA1 est un inhibiteur largement utilisé pour la fusion autophagosome-lysosome et l'acidification de l'autolysosome, ce qui suggère que C11orf54 pourrait favoriser la dégradation de HIF1A de manière dépendante de l'autophagie.

a, b Western blots (a) et résultats quantitatifs (b) des protéines indiquées dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown après un traitement 10 μM MG132 et 100 nM BafA1 pendant 8 h (n = 4 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± ET, ***p < 0,001). c, d Western blots (c) et résultats quantitatifs (d) des protéines indiquées dans les cellules témoins et C11orf54 knockdown après traitement au HBSS et à la rapamycine 1 μM pendant 12 h (n = 4 réplicats biologiques ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, ***p < 0,001). e, f Images représentatives (e) et résultats quantitatifs (f) de GFP-LC3 puncta dans des cellules témoins et C11orf54 knockdown après 48 h de transfection sous traitement normal et 100 nM BafA1 pendant 8 h. (Barre d'échelle = 20 μm ; les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, *p < 0,05, ***p < 0,001). g Le test CCK8 montre la survie cellulaire des cellules PLC/PRF/5 knockdown C11orf54 et des cellules témoins après un prétraitement normal et 0,5 nM BafA1 pendant 12 h (les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± SD, *** p < 0,001). h, i La formation de colonies (h) et les résultats quantitatifs (i) montrent la croissance cellulaire des cellules C11orf54 knockdown PLC/PRF/5 et des cellules témoins lors d'un prétraitement normal et de 0,5 nM de BafA1 pendant 12 h (n = 4 réplicats biologiques ; les données sont présentées comme valeurs moyennes ± ET, **p < 0,05, ***p < 0,001).

En effet, l'inactivation de C11orf54 a augmenté de manière significative le rapport LC3B-II / I et a diminué le substrat d'autophagie p62 lors de la famine et du traitement à la rapamycine (Fig. 7c, d). De plus, le nombre de points lacrymaux autophagosomes GFP-LC3 a augmenté dans les cellules knockdown C11orf54 dans des conditions de traitement normales et BafA1 (Fig. 7e, f). De plus, un prétraitement avec BafA1 pourrait restaurer la viabilité cellulaire et la capacité de formation de colonies dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 7g – i). Cependant, le traitement des inhibiteurs de PI3K (Wortmannin et 3-MA), qui réprimaient la phase précoce de l'autophagie, n'a pas pu restaurer le niveau de protéine de HIF1A dans les cellules knockdown C11orf54 (Fig. 5b, c supplémentaires). Au contraire, un traitement avec un inhibiteur lysosomal (NH4Cl) pourrait sauver l'expression de HIF1A (Fig. 5d supplémentaire). Ces résultats suggèrent que l'inactivation de C11orf54 réduit l'expression de HIF1A au cours de la phase tardive de l'autophagie et des lysosomes.

Une étude récente a montré que HIF1A contenait un motif de type KFERQ, qui pouvait être reconnu et lié par HSC70, puis ciblé sur le complexe multimérique LAMP2A sur le lysosome pour la dégradation de l'autophagie médiée par le chaperon (CMA)45. Ainsi, nous nous demandons si C11orf54 régule la dégradation de HIF1A via l'autophagie médiée par chaperon. Premièrement, nous avons détecté l'expression des composants centraux de la machinerie CMA (HSC70 et LAMP2A). Cependant, C11orf54 n'affecte pas les niveaux d'ARNm et de protéines de HSC70 et LAMP2A (Fig. 6a – d supplémentaires).

Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que C11orf54 pourrait influencer le ciblage de HIF1A vers le lysosome et par la suite la dégradation médiée par le CMA. Ainsi, nous avons effectué un test de co-immunoprécipitation/spectrométrie de masse (Co-IP/MS) pour identifier les protéines qui interagissent potentiellement avec C11orf54 (Fig. 6e supplémentaire). La liste des protéines d'interaction C11orf54 les plus identifiées a été téléchargée dans la base de données en ligne STRING pour construire le réseau d'interaction protéine-protéine (PPI). Ensuite, les gènes hub sélectionnés dans le réseau PPI à l'aide de l'algorithme de centralité de clique maximale (MCC) et du plug-in cytoHubba par le logiciel Cytoscape sont illustrés à la figure 8a. Les 5 principaux gènes hubs étaient HSPA8, HSPA5, HSP90AA1, HSP90AB1 et HSPA9 (Fig. 8a, b). HSPA8 et HSP90AA1 se localisent tous deux au niveau de la membrane lysosomale, d'où ils modulent différentes étapes de CMA46. HSPA8 (HSC70) est responsable du ciblage du substrat pour CMA46. Le test de co-immunoprécipitation endogène a confirmé que C11orf54 interagissait avec HSC70 mais pas avec LAMP2 (Fig. 8c). De plus, grâce au logiciel en ligne KFERQ finder V0.8, nous avons reconnu que C11orf54 contient deux motifs de type KFERQ, qui appartiennent respectivement au motif activé par la phosphorylation et au motif activé par l'acétylation (tableau supplémentaire 3). HIF1A contient un motif de type KFERQ, qui pourrait être reconnu et interagi par HSC70. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que C11orf54 et HIF1A interagissent de manière compétitive avec HSC70. L'interaction entre HIF1A et HSC70 était limitée en présence de C11orf54 (Fig. 8d). Pendant ce temps, la liaison de HIF1A et HSC70 a été affaiblie avec l'augmentation de l'expression de C11orf54 (Fig. 8e). De plus, l'interaction entre HIF1A et HSC70 a été réduite dans les cellules knockdown C11orf54, probablement en raison de la diminution de l'expression de HIF1A. Lorsqu'elle est traitée avec BafA1, l'expression de HIF1A et son interaction avec HSC70 ont été sauvées (Fig. 8f). De plus, l'expression de HIF1A a été restaurée par double knockdown de C11orf54 et LAMP2A (Fig. 8g). Ensemble, ces données démontrent que l'inactivation de C11orf54 favorise la dégradation de HIF1A médiée par CMA en améliorant l'interaction entre HIF1A et HSC70.

a L'analyse du réseau d'interaction protéine-protéine des protéines de liaison C11orf54 identifiées par Co-IP MS. b Spectre de masse de l'image HSPA8. c Immunoprécipitation/Immunoblot analyse des lysats de cellules entières (WCL) et Anti-C11orf54 dérivés de cellules PLC/PRF/5. L'IgG a servi de témoin négatif. d Analyse par immunoprécipitation/immunoblot des lysats de cellules entières (WCL) et Anti-Flag dérivés des cellules 293T transfectées avec Flag-HIF1A et Flag-HIF1A plus pk-Myc-C11orf54 pendant 48 h. L'IgG a servi de témoin négatif (n = 3 réplicats biologiques). e Immunoprécipitation/Immunoblot analyse des lysats de cellules entières (WCL) et Anti-Flag dérivés des cellules 293T transfectées avec Flag-HIF1A, HA-HSC70 et gradient pk-Myc-C11orf54 pendant 48 h. L'IgG a servi de témoin négatif (n = 3 réplicats biologiques). f Analyse par immunoprécipitation/immunoblot des lysats de cellules entières (WCL) et anti-HIF1A dérivés des cellules PLC/PRF/5 sous contrôle et traitement BafA1 100 nM pendant 8 h. L'IgG a servi de témoin négatif (n = 3 réplicats biologiques). g Western blots des protéines indiquées dans les cellules témoins, C11orf54 knockdown et C11orf54, LAMP2A double knockdown.

Dans cette étude, nous avons cherché à délimiter un nouvel effet biologique de C11orf54 chez les mammifères. Nous avons démontré que l'inactivation de C11orf54 diminuait la prolifération cellulaire et augmentait les dommages à l'ADN induits par le cisplatine et l'apoptose. Mécaniquement, C11orf54 et HIF1A interagissent de manière compétitive avec HSC70, l'effecteur critique de l'autophagie médiée par le chaperon, et l'inactivation de C11orf54 favorise la dégradation médiée par CMA de HIF1A. De plus, la dégradation de HIF1A induite par le knockdown de C11orf54 a réduit la transcription de la sous-unité régulatrice de la ribonucléotide réductase M2 (RRM2), qui est une enzyme RNR limitant le débit pour la synthèse et la réparation de l'ADN en produisant des dNTP. Un supplément de dNTP pourrait partiellement sauver les dommages à l'ADN induits par l'inactivation de C11orf54 et la mort cellulaire. De plus, nous avons découvert que l'inhibiteur autophagique BafA1 pouvait sauver le niveau de protéine de HIF1A et le niveau d'ARNm de RRM2, puis restaurer la prolifération cellulaire réduite des cellules knockdown C11orf54. D'autre part, la perte de C11orf54 a réduit l'expression de Rad51 et l'accumulation nucléaire, ce qui a entraîné la suppression de la réparation par recombinaison homologue (Fig. 9).

D'une part, la perte de C11orf54 réduit l'expression de Rad51 et l'accumulation nucléaire. D'autre part, l'inactivation de C11orf54 favorise la liaison de HSC70 à HIF1A pour le cibler pour la dégradation via l'autophagie médiée par le chaperon (CMA), ce qui entraîne une régulation négative de RRM2. Finalement, l'absence de C11orf54 provoque la suppression de la réparation par recombinaison homologue.

C11orf54 est un gène très conservateur chez différentes espèces et est abondant dans les tissus rénaux et hépatiques. Le rôle biologique de C11orf54 n'était pas clair et la localisation subcellulaire était encore controversée. Conrad et al. révélé sa localisation nucléaire par une approche de phénotypage automatique27. Cependant, C11orf54 était principalement localisé dans le cytoplasme et, lorsqu'il était transfecté avec C11orf54-eGFP, il pouvait exister à la fois dans le cytoplasme et le noyau28. Ici, nous avons testé la localisation de C11orf54 endogène avec deux anticorps vérifiés par le test de fractionnement nucléaire/cytosolique et l'analyse d'immunocoloration. Les résultats ont indiqué que C11orf54 était principalement situé dans le cytoplasme (Fig. 1d – g). C11orf54 a été identifié comme une protéine biomarqueur du cancer de l'endomètre, du carcinome à cellules rénales et du carcinome à cellules claires du rein par électrophorèse sur gel bidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse24,25,26. Cependant, C11orf54 était régulé à la baisse dans les tissus de carcinome à cellules rénales par rapport aux tissus normaux correspondants24,25,26. De plus, en analysant l'expression de C11orf54 dans plusieurs échantillons de tissus cancéreux sur la base des données TCGA à l'aide du site Web GEPIA, nous avons constaté que C11orf54 avait une faible expression dans la plupart des tissus cancéreux, en particulier dans KICH (Kidney Chromophobe), KIRP (Kidney renal papillary cell carcinoma ) et SARC (sarcome ; Fig. 7 supplémentaire). Dans notre étude, l'inactivation de C11orf54 pourrait endommager l'ADN et inhiber la prolifération (Figs. 2–3). Ceux-ci suggèrent que l'expression de c11orf54 est diminuée dans le tissu cancéreux par un mécanisme inconnu, qui peut être une boucle de rétroaction pour bloquer la survie des cellules tumorales.

La recombinaison homologue (RH) et la jonction d'extrémité non homologue (NHEJ) sont les principales voies de réparation des DSB ; Rad51 et Ku70 sont deux régulateurs clés, respectivement47,48. Dans notre étude, le knockdown de C11orf54 inhibe l'expression de Rad51 plutôt que de ku70, ce qui implique que C11orf54 peut influencer la réparation des RH. Nous avons utilisé le système de rapporteur HR et avons constaté que l'inactivation de C11orf54 inhibait la capacité de recombinaison homologue. Pendant ce temps, la clairance des foyers p-H2A.X avec l'évolution temporelle de la récupération a été inhibée après l'inactivation de C11orf54.

Des études protéomiques ont montré que la protéine homologue C11orf54 augmentait dans le muscle squelettique des souris résistantes à l'insuline, ce qui suggère que cela pourrait être lié à la voie de signalisation du repliement/dégradation des protéines49. Nos résultats démontrent que la déficience en C11orf54 favorise la dégradation du substrat de macroautophagie p62 et l'accumulation de LC3-II, ce qui signifie l'activation de la macroautophagie (Fig. 6c – f). La voie autophagie-lysosome est l'une des deux principales voies de dégradation des protéines intracellulaires50.

De plus, nous avons constaté que l'inactivation de C11orf54 favorisait la dégradation de HIF1A médiée par CMA (Fig. 7c – f). Mécaniquement, C11orf54 pourrait interagir de manière compétitive avec HSC70 pour dissocier l'interaction HIF1A-HSC70. Le renversement de C11orf54 a aboli son interaction avec HSC70, entraînant une interaction accrue entre HSC70 et HIF1A, favorisant finalement la dégradation de HIF1A médicamentée par CMA (Fig. 8e, f). De manière constante, une étude précédente a montré que HIF1A pouvait être dégradé par CMA via une interaction avec HSC70 et LAMP2A45. Des études antérieures ont montré que la macroautophagie et l'autophagie médiée par le chaperon sont complémentaires dans la dégradation des protéines51. Des études récentes ont suggéré que lorsque les cellules rencontrent des stimuli stressants, la macroautophagie et la CMA pourraient être activées52,53. Ici, nous avons prouvé que la perte de C11orf54 pouvait activer à la fois la macroautophagie et l'autophagie médiée par le chaperon, mais le mécanisme de la régulation de l'autophagie par C11orf54 n'était toujours pas clair, ce qui nécessite une étude plus approfondie dans des travaux futurs.

Une étude précédente a révélé que l'activation de la signalisation HIF1A/STAT3 pourrait réguler à la hausse l'expression de l'ARNm de RRM244, et nous avons également découvert que l'inhibition de la dégradation de HIF1A avec BafA1 pourrait partiellement sauver RRM2 au niveau de l'ARNm. Le niveau de RRM2 fluctue au cours du cycle cellulaire, qui augmente à la fin de la phase G1/début S et se dégrade à la fin de la phase S. Les niveaux de RRM2 sont contrôlés par l'ubiquitine ligase APCCdh1 pour empêcher l'accumulation de RRM2 en phase G154. De plus, en phase G2, après la phosphorylation médiée par CDK, RRM2 est dégradé via Cylin F55. En outre, une étude récente a montré que la régulation à la baisse de RRM2 par l'ARNsi ou le traitement avec l'hydroxyurée, un inhibiteur du RNR, induisait considérablement l'autophagie. Cependant, RRM2 est ciblé pour la dégradation dépendante du protéasome mais indépendante de l'autolysosome lors de l'induction de l'autophagie56. Nos résultats ont montré que l'inactivation de C11orf54 réduisait le niveau de RRM2 en diminuant le niveau d'ARNm et de protéines (Fig. 6a – c). Un supplément de dNTP n'a pas pu sauver l'expression de Rad51, mais pourrait partiellement récupérer les dommages à l'ADN et la prolifération cellulaire médiés par l'inactivation de C11orf54, ce qui signifie qu'il pourrait y avoir un mécanisme alternatif affectant la HR. Pendant ce temps, l'inactivation de C11orf54 favorise l'autophagie (Fig. 7). L'hydroxyurée est un inhibiteur bien établi de RNR en réduisant le radical libre et le centre de fer de RRM257. Dans notre étude, l'hydroxyurée, la camptothécine et le cisplatine favorisent l'expression de C11orf54 de manière dépendante du temps (Fig. 2f, g et Supplémentaire Fig. 3a – d). Ainsi, quel est le réseau de régulation exact entre C11orf54, RRM2 et l'autophagie nécessite également une étude plus approfondie.

En résumé, nous avons découvert un rôle de C11orf54 dans la régulation des dommages et de la réparation de l'ADN par la dégradation médiée par le CMA de HIF1A, entraînant une réduction de RRM2. C11orf54 pourrait interagir de manière compétitive avec HSC70 et supprimer la cible HIF1A de la dégradation du CMA. Le traitement par BafA1 ou dNTP pourrait partiellement sauver les dommages à l'ADN et l'inhibition de la prolifération provoqués par l'inactivation de C11orf54.

Les cellules PLC/PRF/5 et 293T ont été achetées auprès de la Shanghai Cell Bank, Type Culture Collection Committee, Chinese Academy of Sciences. Toutes ces cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Hyclone) et de 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco) à 37 °C sous 5 % de CO2.

Pour le plasmide de surexpression, le CDS C11orf54 a été cloné à partir d'ADNc de cellules 293T à l'aide des amorces d'amplification PCR répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. Le vecteur pk-Myc a été digéré avec BamHI et NotI pour linéariser le vecteur, puis ligaturé CDS C11orf54 et vecteur linéarisé avec la ligase T4 .

Pour la conception de shRNA, utilisez BLOCK-iT™RNAi Designer (http://rnaidesigner.thermofisher.com/) pour déterminer les deux cibles les plus performantes pour C11orf54. Deux séquences cibles sont les suivantes :

shC11orf54-1 : 5'-GGTGCCTACTGGAAAATACA-3';

shC11orf54-2 : 5′-CCAGGTCTCTGTAGTTGATTG-3′.

Le vecteur pLKO.1 a été digéré par EcoRI et AgeI, puis ligaturé avec des oligos shRNA par la T4 ligase.

Pour préparer le lentivirus, nous avons co-transfecté des plasmides shC11orf54 dans des cellules 293T avec psPAX2 et pMD2.G, en utilisant un réactif de transfection polyéthylèneimine (PEI). Les surnageants lentiviraux ont été récoltés 48 et 72h après transfection, puis infectés des cellules PLC/PRF/5 et 293T. Les cellules ont été sélectionnées dans un milieu contenant 1 μg/ml de puromycine 3 jours après l'infection.

L'ARN total a été extrait des cellules à l'aide du régent RNAiso Plus (TaKaRa) en suivant les instructions du fabricant. L'ARN a été rétrotranscrit en ADNc à l'aide du kit de synthèse du premier brin ABScript II (Abclonal) en suivant les instructions du fabricant. Une PCR de transcription inverse quantitative (qRT-PCR) a été réalisée avec SYBR Green Master Mix (Abclonal) sur un système en temps réel CFX96 (Bio-Rad). Les niveaux relatifs d'ARNm ont été calculés en utilisant la méthode 2-ΔΔCt, avec Actb utilisé comme contrôle interne. Les séquences d'amorces pour les gènes cibles sont présentées dans le tableau supplémentaire 1.

Les protéines ont été isolées dans un tampon RIPA glacé (Beyotime) avec des inhibiteurs de protéinase, et les concentrations de protéines ont été déterminées par le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA). Les protéines ont été fractionnées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide, électrotransférées sur la membrane de poly(difluorure de vinylidène) (Millipore) et sondées avec des anticorps primaires et secondaires. Les anticorps primaires et secondaires utilisés sont présentés dans le tableau supplémentaire 2. Les bandes protéiques détectées par les anticorps ont été visualisées par chimiluminescence améliorée (Beyotime) et évaluées à l'aide de l'image J.

Les cellules ont été cultivées jusqu'à 60 % de confluence sur une lamelle. Après traitement, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 20 min. L'accessibilité de l'antigène a été augmentée par un traitement avec 0,2 % de Triton X-100 et bloquée avec 3 % d'albumine de sérum bovin. Les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4°C. Après lavage au PBST, coloration avec l'IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 594 pendant 1 h dans l'obscurité à température ambiante. Après coloration au DAPI, les cellules ont été imagées avec un microscope confocal Leica TCS SP8. Pour la quantification de la colocalisation, les images ont été prétraitées en soustrayant une image et un arrière-plan traités par filtre médian, puis les images ont été traitées avec l'image J.

Les essais de fractionnement nucléaire/cytosolique ont été effectués à l'aide du kit d'extraction de protéines nucléaires et cytoplasmiques (Beyotime) en suivant les instructions du fabricant. En bref, 2 × 106 cellules ont été vortexées avec le réactif A d'extraction du cytoplasme pendant 5 s et incubées sur de la glace pendant 15 min. Ajouter le réactif d'extraction de cytoplasme B et incuber sur de la glace pendant 1 min après 5 s de vortex, puis centrifugé à 4 ° C pendant 5 min à 12 000 g. Le surnageant a été fractionné cytosolique. Ensuite, le culot nucléaire a été lavé trois fois avec du PBS glacé et remis en suspension avec un réactif d'extraction nucléaire, puis vortexé toutes les 2 min pendant 30 s pour un total de 30 min. Centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 12 000 g, et le surnageant a été fractionné nucléaire.

Les cellules PLC/PRF/5 et 293T ont été ensemencées dans des boîtes de 10 cm et transfectées avec les plasmides indiqués. Deux jours après la transfection, les cellules ont été lysées avec du tampon Western/IP sur de la glace puis soniquées. Les concentrations de protéines ont été déterminées dans le dosage de l'acide bicinchoninique (BCA). Les anticorps Flag ou HIF1α ont été utilisés pour immunoprécipiter HSC70 endogène. Les précipités ont été bouillis et chargés sur des gels SDS-PAGE pour Western blot avec l'anticorps secondaire VeriBlot pour la détection IP.

L'apoptose cellulaire a été évaluée par cytométrie en flux à l'aide du kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC (Beyotime) en suivant les instructions du fabricant. En bref, les cellules après traitement ont été trypsinisées, lavées avec du PBS, remises en suspension dans un tampon de liaison et incubées avec une solution de coloration (annexine V/PI = 2:1) dans l'obscurité pendant 20 min à température ambiante. Immédiatement après la coloration à l'annexine V/PI, une analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été effectuée à l'aide du BD FACS VERSE.

La coloration TUNEL utilisait le kit de test d'apoptose One Step TUNEL (Beyotime) en suivant les instructions du fabricant. En bref, après 24 heures de traitement au cisplatine, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min, puis perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,2 % pendant 5 min à température ambiante. Après lavage avec du PBS, incubation des cellules avec la solution de test TUNEL (tampon de marquage/enzyme TdT = 9:1) dans l'obscurité pendant 60 minutes à 37°C. Enfin, les cellules ont été imagées avec Zeiss Axio Imager.Z2.

CCK-8 (Solarbio) a été utilisé pour évaluer la prolifération cellulaire en suivant les instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à la densité de 1 × 103 cellules/puits, puis cultivées dans un incubateur pendant 24 h avant d'être évaluées aux jours -1, -2, -3, -4, -5, respectivement . La solution de CCK-8 a ensuite été versée goutte à goutte dans chaque puits et la plaque a été transférée dans l'incubateur pendant deux heures. Enfin, une valeur de DO à 450 nm a été détectée par MD SpectraMax 190.

Environ 1 × 103 cellules pLKO.1 et shC11orf54 PLC/PRF/5 ont été ensemencées dans une plaque à six puits et traitées avec la concentration indiquée de cisplatine. Les cellules ont été cultivées pendant 10 jours et du paraformaldéhyde à 4 % a été utilisé pour fixer les cellules, suivi d'une coloration avec du cristal violet à 0,5 % pendant 1 heure. Le nombre de colonies (> 50 cellules/colonie) a été compté à l'aide d'un stéréomicroscope et analysé par le logiciel image J58. Tous les échantillons ont été réalisés en triple exemplaire.

La coloration EdU utilisait le kit BeyoClick™ EdU-594 (Beyotime) en suivant les instructions du fabricant. En bref, 10 μM d'EdU ont été ajoutés au milieu frais, puis incubés pendant 2 heures à 37 ° C / 5% de CO2 lorsque les cellules ont été cultivées à 80% de confluence. Après incubation, les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde 4% à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, les cellules ont été incubées avec le tampon de réaction dans l'obscurité pendant 30 min à température ambiante. Après coloration au DAPI, les cellules ont été imagées avec Nikon Ti2 pour visualiser le nombre de cellules EdU-positives. Le taux positif a été déterminé par Image Pro Plus 6.

Les tests Comet ont été effectués comme dans notre étude précédente en utilisant le kit COMET Assay (Enzo) en suivant les instructions du fabricant59. Combinez les cellules à 1 × 105/ml avec de l'agarose LM fondu dans un rapport de 1:10 (vol/vol) et pipettez immédiatement sur une lame COMET. Placer les lames à plat à 4 ° C dans l'obscurité pendant 30 min, puis immergées dans la solution de lyse pré-réfrigérée à 4 ° C pendant 30 min. Retirer les lames, scotcher doucement l'excès de tampon des lames, laver dans du tampon TBE, puis transférer dans une chambre d'électrophorèse horizontale. Une tension (1 V/cm) a été appliquée pendant 10 min. Enlevez très doucement l'excès de TBE avec du ruban adhésif, plongez les lames dans de l'éthanol à 70 % pendant 5 minutes et laissez sécher les échantillons à l'air. Les lames ont été colorées au SYBR Green puis analysées par microscopie à fluorescence. Au total, 70 à 150 cellules ont été évaluées dans chaque échantillon à l'aide du logiciel COMET Assay Software Project (logiciel CASP). % ADN de la queue = ADN de la queue/(ADN de la queue + ADN de la tête), moment de la queue = longueur de la queue × % de l'ADN de la queue.

Le test d'activité de réparation HR a été réalisé comme l'étude précédente37. En bref, les cellules pLKO.1 et shC11orf54 PLC/PRF/5 ont été transfectées avec pDR-GFP et pCBA-Scel. Après deux jours, les cellules ont été récoltées et analysées par cytométrie en flux activée par fluorescence (FACS) pour examiner le pourcentage de cellules GFP-positives. Les stratégies de déclenchement sont présentées dans la Fig.8 supplémentaire.

L'ARN total a été extrait des cellules pLKO.1 et shC11orf54 PLC/PRF/5. L'ARN a ensuite été séquencé par le service WuXiNextCODE Tec RNA-seq (n = 2). L'analyse GO des changements significatifs des gènes différentiellement exprimés a été réalisée à l'aide du site Web de Metascape (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)60. Pour l'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes, nous avons appliqué GSEA v4.1.0 à diverses signatures de gènes caractéristiques fonctionnelles comme décrit précédemment61,62. La GSEA a été réalisée à l'aide des ensembles de gènes "Hallmark" ou "KEGG" pour identifier les signatures enrichies. Les ensembles de gènes avec un FDR < 0,25 et une valeur de p nominale < 0,05 ont été considérés comme significatifs.

Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart type (SD). Le niveau de signification statistique a été fixé à p < 0,05 à l'aide d'un test t de Student bilatéral non apparié. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism. La taille de l'échantillon et des répétitions a été indiquée dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données RNA-seq générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Sequence Read Archive (SRA) sous le code d'accession PRJNA939822, ID d'échantillon : SRR23648017, SRR23648018, SRR23648019 et SRR23648020. Les gels de transfert Western non édités / non recadrés sont inclus dans la Fig. 9 supplémentaire. Les données sources derrière les graphiques de l'article sont incluses dans les données supplémentaires 1. Toutes les autres données sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable.

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Nous remercions le Dr Guo Chen de l'Université de Jinan pour les plasmides pDR-GFP et pCBA-SceI. Ce travail a été soutenu financièrement par le National Key R&D Program of China (2021YFA0804903), la National Natural Science Foundation of China (Grants. 32170772, 32270810, 81800833 et 81802189), le 111 Project (B16021) et la Natural Science Foundation of Province du Guangdong (subvention 2021A1515011227, 2022A1515140040, 2019A1515011847 et 2019A1515010591). QZ remercie également le soutien de KC Wong Education Foundation.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Junyang Tan, Wenjun Wang.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Jianshuang Li, Qinghua Zhou.

Le sixième hôpital affilié de l'Université de Jinan, Université de Jinan, 523573, Dongguan, Guangdong, Chine

Junyang Tan, Wenjun Wang, Xinjie Liu, Jinhong Xu, Yaping Che, Yanyan Liu, Jiaqiao Hu, Liubing Hu, Jianshuang Li et Qinghua Zhou

Institut de recherche translationnelle biomédicale, Centre des sciences de la santé (École de médecine), Université de Jinan, 510632, Guangzhou, Guangdong, Chine

Junyang Tan, Wenjun Wang, Xinjie Liu, Jinhong Xu, Yaping Che, Yanyan Liu, Jiaqiao Hu, Liubing Hu, Jianshuang Li et Qinghua Zhou

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Le projet a été supervisé par JL et QZ Les expériences ont été conçues par JL et QZ, réalisées par JT, WW, XL, JX, YC, YL, JH et LH ; JT, WW et JL ont analysé les données. JT, WW, JL et QZ ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont revu le manuscrit.

Correspondance à Jianshuang Li ou Qinghua Zhou.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Christina Karlsson Rosenthal. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Tan, J., Wang, W., Liu, X. et al. C11orf54 favorise la réparation de l'ADN en bloquant la dégradation médiée par le CMA de HIF1A. Commun Biol 6, 606 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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Reçu : 23 septembre 2022

Accepté : 19 mai 2023

Publié: 05 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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