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May 07, 2023

Caractérisation préclinique et anti

Transduction du signal et thérapie ciblée

Transduction du signal et thérapie ciblée volume 8, numéro d'article : 27 (2023) Citer cet article

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Monsieur le rédacteur,

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), l'agent causal de la pandémie mondiale de coronavirus 2019 (COVID-19), s'est avéré être un pathogène respiratoire hautement virulent avec une capacité évolutive imprévisible, posant une menace persistante à l'humanité. Au moment de la publication de ce manuscrit, la variante dominante d'Omicron est caractérisée par une infectiosité significativement plus élevée, et les sous-variantes émergentes affichent sensiblement une neutralisation échappée induite à la fois par la vaccination et l'infection précédente, augmentant le risque de percée ou de réinfection du vaccin. des médicaments antiviraux actifs sont désespérément nécessaires comme contre-mesures pour réduire la transmission virale et le risque de progression de la maladie vers une maladie grave ou la mort.

Le remdesivir (RDV) est le premier analogue nucléotidique approuvé pour le traitement du COVID-19. L'administration précoce du RDV aux patients à haut risque non hospitalisés pourrait réduire le risque d'hospitalisation ou de décès de 87 %.2 Cependant, en tant que médicament intraveineux obligatoire, le RDV n'est pas facilement accessible aux patients ambulatoires COVID-19. Auparavant, nous avons constaté que le nucléoside C parent 1′-CN-4-aza-7,9-didéazaadénosine (GS-441524) était plus puissant que le RDV contre le SRAS-CoV-2 in vitro.3 Dans le cadre d'un effort continu pour améliorer pharmacogabilité et biodisponibilité orale du GS-441524,4 nous rapportons ici la caractérisation préclinique et l'efficacité anti-SARS-CoV-2 d'un candidat-médicament nucléosidique oral potentiel, ATV014.

Initialement, nous avons conçu et synthétisé une série de dérivés d'adénosine basés sur la stratégie des promédicaments en introduisant sélectivement des esters au niveau du groupe 5′-OH du GS-441524 pour obtenir 4a ~ 4 m (Fig. S1 supplémentaire). Parmi ces composés nouvellement synthétisés, l'analogue de cyclohexyl carboxylate 4a (ATV014) (Fig. 1a, EC50 = 0,48 μM) a été identifié comme un agent puissant contre le réplicon du SRAS-CoV-2, qui était environ 3,4 fois plus puissant que celui de GS -441524 (EC50 = 1,644 μM) (tableau supplémentaire S1). ATV014, l'analogue tétrahydro-2H-pyran-4-carboxylate (4 h) et l'analogue palmitate (4 l) ont été choisis pour comparer le profil PK chez les rats SD (tableau supplémentaire S2). Avec une dose orale unique de 25 mg/kg, ATV014 a démontré une amélioration de la biodisponibilité orale (F%) de 53,4 % et une T½ de 1,9 h, supérieure à celle de 4 h et 4 l. Compte tenu de la PK et de la puissance orales favorables, ATV014 a été sélectionné pour d'autres expériences anti-SARS-CoV-2 avec des virus vivants. Comme le montre la Fig. 1b, dans les cellules Vero E6, les activités antivirales d'ATV014 contre B.1 (IC50 = 0,46 μM), Beta (IC50 = 0,13 μM), Delta (IC50 = 0,24 μM) et Omicron (IC50 = 0,013 μM ) ont été significativement améliorés par rapport à RDV et GS-441524. Les valeurs moyennes de concentration cytotoxique (CC50) d'ATV014 dans les cellules Vero E6 étaient de 263,8 μM. Notamment, l'indice thérapeutique (CC50/EC50) d'ATV014 contre le variant Omicron a atteint 20292. De plus, contre la souche B.1 dans les cellules A549-ACE2, ATV014 présentait une valeur EC50 de 0,0562 ± 0,016 µM (Fig. S2 supplémentaire). Ces résultats ont démontré la puissance élevée, en particulier contre le récent Omicron répandu, et la toxicité relativement faible de l'ATV014.

Définition d'un médicament ATV014 anti-SRAS-CoV-2 potentiel par voie orale et sa caractérisation préclinique. a Les structures chimiques du remdesivir, GS-441524 et ATV014. b Activité antivirale de RDV, GS-441524 et ATV014 contre les souches B.1, Beta, Delta et Omicron de SARS-CoV-2 et cytotoxicité correspondante dans les cellules Vero E6. c Schéma de l'efficacité prophylactique dans un modèle de souris K18-hACE2. Des souris K18-hACE2 ont été inoculées par voie intranasale avec la variante SARS-CoV-2 Delta (5 × 102 virus PFU par souris) et ont été immédiatement traitées par voie orale avec le véhicule, ATV014 (100, 300 mg/kg) ou EIDD-2801 (300 mg/kg ), avant l'inoculation et poursuivie pendant trois jours (bis in die (BID), n = 4 par groupe). Les résultats suivants ont démontré l'abondance de copies du gène SARS-CoV-2 N dans les poumons de souris via qRT-PCR (réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel) et la viabilité du virus via FFA (test de formation de foyer) à 3 dpi. La limite de détection de qRT-PCR était de 0,5 copies/μL. La ligne pointillée rouge indique la limite de détection pour le FFA. d Schéma de l'efficacité thérapeutique. Des souris K18-hACE2 ont été inoculées par voie intranasale avec la variante SARS-CoV-2 Delta (5 × 102 PFU par souris) et ont été traitées avec le véhicule, ATV014 (10, 20, 50, 100 ou 200 mg/kg), ou EIDD-2801 (200 mg/kg) deux heures après l'infection par le SARS-CoV-2 (n = 10 par groupe). Les résultats suivants ont montré l'abondance de copies du gène SARS-CoV-2 N dans les poumons de souris via qRT-PCR et la viabilité du virus via FFA à 3 dpi. e Images H&E représentatives de coupes pulmonaires des poumons des souris traitées avec le véhicule, 100 mg/kg traitées avec ATV014 et 200 mg/kg traitées avec ATV014. f Concentrations plasmatiques moyennes d'ATV014 après administration intraveineuse unique (1,0 mg/kg) et orale (5 et 20 mg/kg) d'ATV014 chez des souris CD1 (n = 3 par groupe). administration unique intraveineuse (1,0 mg/kg) et orale (20, 40 et 80 mg/kg) d'ATV014 chez des rats SD (n = 6 par groupe) et administration unique intraveineuse (1 mg/kg) et orale (5, 15 et 45 mg/kg) chez des chiens beagle (n = 6 par groupe). g Distribution tissulaire du métabolite clé GS-441524 chez le rat mâle après une administration orale unique d'ATV014 à 80 mg/kg. SI : intestin grêle ; LI : gros intestin. Les barres d'erreur indiquent SEM. Un test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour l'analyse statistique. ∗P ≤ 0,05 ; ∗∗P ≤ 0,005 ; ∗∗∗P ≤ 0,0005 ; ∗∗∗∗P ≤ 0,0001

Par la suite, nous avons évalué l'efficacité prophylactique et thérapeutique in vivo de l'ATV014 par voie orale chez les souris transgéniques K18-hACE2 infectées par la variante Delta (Fig. 1c et 1d) avec le molnupiravir (EIDD-2801) comme composé de référence.5 Le traitement a été initié au moment d'infection dans le modèle prophylactique. À 3 jours après l'inoculation (dpi), les copies d'ARN viral chez les souris traitées avec ATV014 (100 et 300 mg/kg, BID) ont été significativement réduites. Les titres de virus chez les souris traitées par ATV014, mesurés par FFA (test de formation de foyers), ont été réduits à la limite de détection proche, indiquant que les virus infectieux dans les poumons ont été éliminés de manière significative. Pour déterminer la dose efficace la plus faible dans le cadre thérapeutique, ATV014 a été administré 2 h après l'infection. 20, 50, 100 et 200 mg/kg d'ARN viral réduit en fonction de la dose d'ATV014 dans les poumons. ATV014 à 200 mg/kg a réduit de manière significative l'ARN viral d'environ deux ordres de grandeur (1,4 × 103 copies/μl par rapport à 1,7 × 105 copies/μl dans le groupe véhicule), qui était plus puissant par rapport à 200 mg/kg de molnupiravir (5,4 × 103 copies/μl). Dans le test de formation de foyers, 50 mg/kg et une dose supérieure d'ATV014 ont réduit la concentration de virus infectieux en dessous de la limite de détection. L'analyse histopathologique a révélé que l'ATV014 protégeait le tissu pulmonaire des lésions inflammatoires interstitielles et des dommages causés par l'infection par le SRAS-CoV-2 Delta (Fig. 1e).

Le processus de synthèse à grande échelle de l'ATV014 a été optimisé pour assurer l'approvisionnement de l'étude clinique. ATV014 a été obtenu sous forme d'anhydrate avec une cristallinité élevée et physiquement stable à 40 °C/75 % HR (ouvert) et 60 °C (ouvert) pendant 30 jours, affichant une bonne stabilité chimique. ATV014 avait une valeur expérimentale favorable de log P de 1,99 et une valeur de pKa de 3,5. Le GS-441524 a montré une perméabilité modérément faible avec la valeur Papp (A à B) de 3,62 cm/s × 10−6 dans les tests de perméabilité des cellules Caco-2. En revanche, ATV014 s'est comporté comme un composé méso-hypertonique (Papp (A à B) = 8, 69 cm / s × 10−6) et était un transporteur d'efflux de substrat faible avec un taux d'efflux de 2, 5 (tableau supplémentaire S3). L'amélioration de la perméabilité d'absorption passive explique en partie l'amélioration de l'absorption orale d'ATV014. Après une administration orale unique de 20, 40 et 80 mg/kg d'ATV014 à des rats SD, la biodisponibilité (F) était de 49 %, 43 % et 68 %, respectivement (Fig. 1f et Tableau supplémentaire S4). En comparaison, la biodisponibilité orale du GS-441524 après administration de RDV n'était que de 14 % chez le rat (tableau supplémentaire S5). Pendant ce temps, la biodisponibilité orale du GS-441524 après administration d'ATV014 variait de 66 à 69 % chez la souris et de 78 à 105 % chez le chien beagle (Fig. 1f et tableau supplémentaire S6). La Cmax et l'ASC ont augmenté en fonction de la dose chez les trois espèces. Lors de l'administration répétée sur 7 jours d'ATV014 par voie orale chez le rat (40 mg/kg, BID) et le chien (15 mg/kg, BID), les valeurs d'AUClast et de Cmax au jour 1 et au jour 7 étaient équivalentes, ce qui indique qu'il ne s'est pas accumulé. dans le corps lors d'administrations répétées (tableaux supplémentaires S7 et S8).

Une étude du métabolisme a montré que six métabolites d'ATV014 ont été détectés dans des échantillons d'incubation de souris, quatre dans des échantillons d'incubation de rat, de chien et d'humain et trois dans des échantillons d'incubation de singe (tableau supplémentaire S9 et Fig. S3). Le métabolite hydrolysé M3 (GS-441524) était le principal métabolite dans les hépatocytes des cinq espèces, avec des pourcentages de surface de pic de 93,06 %, 90,27 %, 92,45 %, 96,30 % et 95,64 %, respectivement. Une étude plus approfondie de la distribution tissulaire a montré que le métabolite primaire GS-441524 se distribuait largement et rapidement dans les tissus de rat (Fig. 1g et tableau supplémentaire S10), en particulier dans les poumons pour être au-dessus des concentrations thérapeutiques. ATV014, GS-441524 et la forme triphosphate active (RTP) ont démontré un profil de sélectivité hors cible favorable dans un large panel de dépistage de 87 cibles. Les taux d'inhibition étaient <50% à 20 μM contre toutes les cibles criblées, sauf que ATV014 inhibait 53% de l'activité du transporteur d'adénosine (tableau supplémentaire S11). Pour les études de toxicité à dose unique, la dose maximale tolérée (DMT) d'ATV014 était de 2000 mg/kg chez le rat et le chien. Pendant 14 jours d'études de toxicité à doses répétées, les doses sans effet nocif observé (NOAEL) d'ATV014 étaient de 400 mg/kg et 100 mg/kg, et la DMT était de 800 mg/kg et 300 mg/kg chez le rat et le chien, respectivement . ATV014 et GS-441524 n'ont montré aucune mutagénicité ni clastogénicité en ce qui concerne les résultats négatifs du test d'Ames utilisant Salmonella, E. coli et le test du micronoyau dans les cellules de la moelle osseuse. Ces études d'efficacité anti-SARS-CoV-2 et ces données précliniques ont validé l'ATV014 en tant qu'antiviral oral puissant pour le traitement du COVID-19 avec des propriétés pharmacocinétiques et un profil d'innocuité favorables, qui fait l'objet d'essais cliniques (phase 1, NCT05504746 ; essai initié par l'investigateur , ChiCTR2200064093).

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Ce travail a été soutenu par Shenzhen Science and Technology Program (JSGG20200225150431472, JSGG20210901145403012 & KQTD20180411143323605), Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Grant #2020A1515110361), National Key Research and Development Program of China (#2021YFC086 5100), recherche et développement dans un domaine clé Programme de la province du Guangdong (2021B1111110001) et Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention #32041002, #82150206). DG est également soutenu par le Guangdong Zhujiang Talents Program (#2016LJ06Y540) et le National Ten-thousand Talents Program. Les auteurs remercient Lu Zhang, Ruyan Liao, Yongxia Shi et Jun Dai du Centre technologique du district des douanes de Guangzhou pour leur aide dans l'expérience d'efficacité in vivo. Nous remercions également les autres participants au projet, y compris Guanguan Li, Shuo Li et Xinjun Liu de Medi-X Pingshan, Southern University of Science and Technology pour le soutien dans l'étude préclinique.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Qifan Zhou, Sidi Yang, Liu Cao, Yang Yang, Tiefeng Xu

Shenzhen Key Laboratory of Small Molecule Drug Discovery and Synthesis, Department of Chemistry, College of Science, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies and Medi-X Pingshan, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Guangdong, 518000, Chine

Qifan Zhou, Qishu Chen, Yingjun Li et Xumu Zhang

Centre d'études sur les infections et l'immunité (CIIS), École de médecine, Campus de Shenzhen de l'Université Sun Yat-sen, Shenzhen, Guangdong, 518107, Chine

Sidi Yang, Liu Cao, Tiefeng Xu et Deyin Guo

Laboratoire de Guangzhou, Bio-Island, Guangzhou, Chine

Sidi Yang et Deyin Guo

Shenzhen Key Laboratory of Pathogen and Immunity, Centre national de recherche clinique sur les maladies infectieuses, State Key Discipline of Infectious Disease, Shenzhen Third People′s Hospital, Second Hospital Affiliated to Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Chine

Yang Yang et Lu de Hongzhou

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les promédicaments nucléosidiques synthétisés par QZ et QC ; QZ, YL et SY ont participé à l'interprétation des données, à la préparation des figures et du manuscrit ; SY a effectué des expérimentations animales ; LC, TX et YY ont effectué des tests d'inhibition du réplicon viral et au niveau cellulaire ; YL a analysé les résultats des études pharmacocinétiques et de toxicité ; XZ, DG et YL ont conçu et conçu le projet, initié une collaboration avec HL ; DG et XZ étaient responsables de l'ensemble du projet en tant que superviseurs. Tous les auteurs ont lu et approuvé l'article.

Correspondance à Yingjun Li, Deyin Guo ou Xumu Zhang.

L'Université des sciences et technologies du Sud et l'Université Sun Yat-sen ont déposé des demandes de brevet liées à ces travaux. XZ, DG, LC, Y.Li., TX et QZ sont répertoriés comme inventeurs sur cette demande. XZ et DG sont co-fondateurs d'une start-up, Shenzhen AntiV Pharma Co., Ltd. Tous les autres auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Tous les protocoles d'études sur les animaux ont été approuvés par le comité du bien-être animal et toutes les procédures utilisées dans les études sur les animaux étaient conformes aux directives et aux politiques du comité de protection et d'utilisation des animaux des unités de recherche respectives.

Caractérisation préclinique et efficacité anti-SRAS-CoV-2 de l'ATV014 : Prodrogue orale de cyclohexanecarboxylate de 1′-CN-4-aza-7,9-didéazaadénosine C-nucléoside

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Réimpressions et autorisations

Zhou, Q., Yang, S., Cao, L. et al. Caractérisation préclinique et efficacité anti-SRAS-CoV-2 d'ATV014 : un promédicament oral de cyclohexanecarboxylate de 1′-CN-4-aza-7,9-didéazaadénosine C-nucléoside. Sig Transduct Target Ther 8, 27 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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Reçu : 11 août 2022

Révisé : 8 décembre 2022

Accepté : 03 janvier 2023

Publié: 12 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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